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1、叶绿体的 分离及荧光观察,细胞生物学实验四,目的要求,通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。,实验原理,将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。,实验用品,材料：菠菜叶片。 试剂：碳酸钙、丙酮、甲醇、 醋酸酮、氢氧化钾、乙醚、盐酸。 器材：研钵、移液管、吸球、 天平、分液漏斗、量筒、试管。,实验方法,一、叶绿体的分离与观察 1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除
2、叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。 2. 利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀浆35min。 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。 5. 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体(混有部分细胞核)。 6. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。,观 察,7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。 (1)在普通光镜下观察。 (2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。 (3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。,二、菠菜叶手切片观察 用剔须刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面置于载玻片上，滴加12滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。 (1)在普通光镜下观察。 (2)在荧光显微镜下观察其直接荧光。 (3) 观察间接荧光：向手切片上滴加12滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液, 加盖片后可在荧光显微镜下观察间接荧光。,思考题,1、叶绿体分离的实验原理是什么？在分离叶绿体时应注意些什么问题？ 2、普通光学显微镜与荧光显微镜有何异同点？,