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1、兽医微生物学实验,实验一 显微镜的构造和使用及细菌形态结构的观察,进入实验室的注意事项,1。穿工作服 2。书本等物品放入抽屉 3。树立无菌观念 4。不能抽烟、吃零食 5。爱护公物，注意节约,一、目的要求,1。了解显微镜的简单构造和原理 2。学习掌握油镜的使用技术 3。观察细菌的基本形态,二、普通光学显微镜的简单原理,1。支持部分：镜臂、镜台、镜筒、粗细调节器 2。放大部分：接目镜、接物镜 3。照明部分：反光镜、聚光器、滤光镜,三、几种显微镜的简单原理 1。暗视野 2。相差 3。荧光 4。电子 四、油镜的识别及使用原理 五、使用完毕显微镜及标本片的处理,作 业,1。普通显微镜与油镜使用上有何区别
2、？ 2。绘出你所观察到的细菌形态 3。你最喜欢哪个细菌，为什么？,枯草杆菌，革兰氏染色，G+,枯草杆菌，芽胞简易染色,金黄色葡萄球菌，革兰氏染色， G+,大肠杆菌，革兰氏染色,G-,破伤风梭菌，芽胞染色,实验二 细菌的抹片制备及染色,一、目的要求,1。掌握细菌抹片的制备方法 2。掌握几种常用的染色方法和技术及无菌操作技术 3。巩固显微镜的使用，了解细菌的染色特性、形态,二、材料,大肠杆菌：斜面，肉汤 金黄色葡萄球菌：斜面，肉汤 枯草杆菌：斜面,三、制片及染色步骤,取干净玻片-抹片-干燥-固定-染色-干燥镜检,四、常用的几种染色方法,（一）革兰氏染色法,1。草酸铵结晶紫染色1-2，水洗 2。革兰
3、氏碘液媒染1-2，水洗 3。95%酒精脱色约30-1，水洗 4。沙黄水溶液复染10 -30 ，水洗 5。吸干，镜检,（二）姬姆萨染色法,1。甲醇固定3 ，时间长短均可 2。姬姆萨液足量30 或数小时至24h，水洗 3。吸干镜检,（三）瑞氏染色法,抹片干燥无需固定，直接滴加染色1-3 ，再加等量中性蒸馏水，轻轻混匀，续染15 ，水洗，吸干镜检,（四）美兰染色法,1。固定好抹片加上足量染液2-3 2。吸干镜检,作业,1。说说你的实验结果 2。根据实验体会，你认为制备染色标本时应注意哪些事项？ 3。作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败关键一步是什么？,实验三 培养基的制备,一、目的要求 1
4、。掌握基础培养基制备的原则和要求 2。掌握一般培养基的制备过程及pH测定 二、实验材料（略）,三、制作的一般要求 须含有细菌生长所需的营养物质 盛器需无菌，且不含抑菌生长的物质 pH应符合细菌生长的要求，一般在7.27.6 要过滤，应为透明或半透明状，以便观察细菌生长变化 制好后需高压灭菌,四、步骤 称取 溶解调pH 过滤分 灭菌菌检 普通肉汤的制备 蛋白胨 10g，牛肉膏 5g，NaCl 5g K2HPO4 1g，蒸馏水 1000ml 分别称取以上物品，置铝锅内加热溶解。取5ml肉汤于试管内用0.1mol/L NaOH校pH至7.4-7.6，根据其用量计算所配培养基需用的1mol/L NaO
5、H用量，用滤纸过滤，分装至短试管,所需1N NaOH的量,培养基量 校正时所需0.1mol/L NaOH量 5 10,普通琼脂培养基的制备 取已配好的肉汤500 mL于铝锅内，加入琼脂10g，加热溶解，用纱布、棉花过滤、分装,灭菌：将分装好的培养基扎口后置高压灭菌锅内121（15磅）20-30分钟 菌检：抽取样品，置37 24h,作 业,制作培养基时应注意哪几点？ 为什么肉汤培养基在高压灭菌前pH要略调高一些？ 为什么校正pH时，调校少量培养基用0.1 mol/L NaOH，而调校大量培养基时用1 mol/L NaOH？ 说说你们组的产量和品质,实验四 细菌分离培养及移植,一、目的,掌握细菌分
6、离培养的基本要领和常用方法 使被检材料适当稀释，以求获得独立单在菌落,二、需氧分离培养法,平板分离培养法 芽胞需氧分离培养法 化学药品分离培养法 实验动物分离培养法,三、实验内容,平板划线 肉汤培养 斜面移植 接种完毕标明细菌、日期、姓名，置37培养24h,四、作业,何谓纯培养？分离培养的目的何在？ 在挑取固体培养物上的细菌作平板划线时，为什么每次都要将接种环上剩余的细菌烧掉？ 为什么要把培养皿倒置培养？,实验五 药敏试验,一、目的要求,学会药敏试验的操作方法及观察抑菌圈的范围,二、试验材料,菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 药敏纸片： 卡那霉素，阿米卡星，红霉素，复方新诺明，呋喃妥因，庆大霉素
7、，链霉素 镊子、酒精灯等,三、操作步骤,1. 每人取平板接种细菌，致密划线 2. 以无菌镊子将各种药敏纸片分别是贴于培养基表面 3. 倒置，37培养24h，观察结果,四、结果判定,根据药敏纸片周围有无抑菌圈及其大小，来判断该菌对各种药物的敏感程度，分为： 高度敏感、中度敏感、 低度敏感、不敏感,五、作业,1. 什么叫细菌对抗菌药物的敏感度？了解它有何实际意义？ 2. 写出你所做的药敏试验结果。,实验六 细菌的生化试验,一、目的要求,1。了解细菌生化试验在细菌学诊断上的重要意义 2。掌握几种生化试验的方法,二、实验材料,大肠杆菌 产气杆菌 变形杆菌 兔沙门氏菌,三、实验内容及操作,1。糖或醇发酵
8、试验 2。靛基质（吲哚）试验 3。甲基红（MR）试验 4。VP二氏试验 5。枸椽酸盐利用试验 6。硫化氢试验 7。尿素试验 8。细菌运动力试验,作业,1。生化反应记录表 2。解说你所做的生化反应各种原理 3。以上生化反应试验哪几个是分解糖？哪几个是分解蛋白质？,1. 靛基质实验（蛋胨水）,取出试管 乙醚1ml，振荡静置，待分层后沿管壁加入对二甲基氨基苯甲醛45滴 阳性者在分界处出现玫瑰吲哚,2. 葡胨水一分为二,2。1 甲基红试验 取出试管甲基红35滴，摇匀红色为阳性，黄色为阴性，橙色为可疑 2。2 VP试验 取出试管VP甲液0.6ml，再加VP乙液0.2ml，充分混匀静置，15分钟后看结果，
9、红色为阳性，不变为阴性,实验七 病毒鸡胚培养（一）,一、目的要求,掌握鸡胚接种技术和收获病毒方法,二、实验材料,9-10日龄鸡胚 新城疫病毒 灭菌注射器 棉球（酒精、碘酊）,三、内容及操作,1。绒毛尿囊腔接种 选9-10日龄鸡胚，先观察鸡胚发育情况 划出气室，离气室边缘5mm处作一记号 消毒打孔：记号处和顶端各打一孔 吸取病料，由注射孔刺入3-5mm，注射0.1-0.2ml病料 拨出针头，石蜡封闭两孔（先下后上）,蛋壳注明日期，学号以及病毒名称 置37培养，24h内死亡或血管不清者弃去 以后每日照蛋2次，死胚置4 保存，96h不死者将其冻死 6h冷冻后可收获尿囊液检查,实验八 病毒鸡胚培养（二）,收获尿囊液,气室消毒 击破气室、卵壳并弃去 无菌小镊撕支壳膜再撕去绒尿膜和羊膜 无菌吸管吸取尿囊液置无菌瓶中 待检测,HA及HI试验,掌握HA和HI的基本操作技术，了解其实用价值,血球凝集试验（HA）,弃去,血球凝集抑制试验（HI）,弃去,作业,常用鸡胚接种方法有哪些？ HA和HI试验中，哪个是特异的抗原抗体反应？,