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1、免疫学实验技术,免疫学技术-抗原抗体反应,可对抗原或 抗体进行定性、 定量、定位的 检测 影响因素: 电解质、温度 酸碱度,免疫标记技术: 是指用荧光素、放射性同位素、 酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂,标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应,特点:高度灵敏、特异、快速, 定性、定量、 定位 分类:免疫酶技术、免疫荧光技术、放射 免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶 体金技术和发光免疫测定,.ELISA .免疫组化 .荧光抗体标记 .荧光原位杂交（FISH） .分光光度法,.酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）,以酶标记抗体或抗原进行的抗体
2、抗原反应. 酶结合物具有双功能:高度特异的免疫反应、 生物催化放大作用 基本方法:间接法、双抗体夹心法、竞争法、 生物素-亲和素系统,间 接 法,a.将已知可溶性抗原吸附于载体 b.温育后清洗 c.加入可能含特异性抗体的待检液 d.温育后清洗 e.加入酶标记的二抗 f.温育后清洗 g.加入酶作用底物 h.测定反应颜色深浅,a.将已知抗体吸附于载体上 b.温育后清洗 c.加入可能含特异性抗原的待检液 d.温育后清洗 e.加入酶标记特异性抗体 f.温育后清洗 g.加入酶作用底物 h.测定颜色反应深浅,双抗体夹心法,a、将已知抗体吸附于载体上 b、温育后清洗 c、加入可能含特异性抗原的待检液和酶标记
3、的已知抗原液 d、温育后清洗 e、加入酶作用底物 f、测定颜色反应深浅,竞 争 法,生物素-亲和素系统（biotin-avidin system） 生物素:一种维生素H,经活化后可与抗体、抗原、 酶以多 配一方式共价结合,且不影响它们的活性 亲和素:从卵蛋白中提取的一种碱性糖蛋白,可与 酶偶合,以一配多的方式对生物素有很强的亲和力 BAS用于检测的基本方法：BAB法或BRAB法/BA 法/ABC法,生物素-亲和素系统,BAS法与常规酶法,ELISA操作注意事项,1.待检样品不应反复冻融 2.加样前充分混匀样品 3.洗板:保证洗涤次数,确保冲洗干净 4.加完终止液在要求时间内上机检测,反应温度最
4、好在37,ELISA检测标本,1.血清或血浆 2.尿液 3.脑脊液、关节液等体液 4.细胞培养上清等,ELISA试验用耗材、试剂及仪器,耗材:移液器、吸头、酶标板、滤纸 试剂:酶标抗体、抗体稀释液、封闭液、底物 溶液、终止液 仪器:酶标仪,ELISA结果分析,1.根据标准品的含量及检测OD值结果,应用线性回归方程进行统计分析,可求得待测样品的定量值 2.上机前将标准品的数量及含量按要求在酶标仪上进 行设置,机器自动计算打印出标准曲线及各待测样品的定量结果,.免疫组织化学技术,免疫组化是组织化学的一种,是利用已知的 抗体或抗原能特异性结合的特点,通过化学反 应使结合在特异性抗体上显示剂(酶、金属
5、离 子、同位素等)显示一定的颜色,在显微镜下观 察颜色的变化,在抗原抗体结合部位确定组织、 细胞结构的化学成份或化学性质,1.阳性标记色度特征,免疫组化细胞阳性程度与抗原含量、分布密 度、标记方法有关. 一般抗原含量越多、密度 越高、标记方法越敏感,阳性显色则越强.淡黄 色,弱阳性;黄色,阳 性;棕黑色,强阳性 .结果判 断中,后两者有意义,前者除标本处理和方法学 因素外,与细胞轻度异常表达及某些细胞摄取 了周围组织抗原有关,2.阳性标记细胞学特征,免疫组化阳性细胞反映抗原在细胞中的定位 和分布情况.阳性细胞以拟标记的细胞为前提, 阳性表达必须在细胞特定的抗原部位,若不在 抗原所在部位的阳性表
6、达和非目标细胞即使 阳性也不应作为判断依据.根据抗原在细胞中 分布和阳性颗粒沉淀部位可分5种类型：, 胞膜型 阳性颗粒主要分布于细胞膜表面,形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细胞.此类型常见于某些膜抗原,如上皮膜抗原（EMA）、白细胞共同抗原（LCA）及B细胞、T细胞、粒细胞相关抗原（GAA）, 胞核型 阳性颗粒定位于细胞核,呈均匀分布位于核膜下,有的呈小斑块状不规则分布.多见增殖细胞核抗原、Ki-67及激素受体中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和基因p53等, 胞浆型 阳性颗粒主要分布于细胞浆.大部分抗原均属此型,如细胞角蛋白、波形蛋白、神经丝蛋白、肌红蛋白、1-抗胰糜蛋白酶及前列腺特异性抗
7、原（PSA）等.抗原在胞浆内分布通常为弥漫性或局限性.弥漫性是阳性颗粒弥漫而均匀地分布于整个细胞浆,局限性是指阳性颗粒呈小斑点状或斑块状局限于细胞浆中的某一部位、核周或细胞浆的一侧, 微绒毛型 抗原颗粒主要分布于腺癌细胞的微绒毛,胞浆和胞膜可以是阳性或阴性表达.此形最常见于各种腺癌,如甲状腺、乳腺、胃肠、胆道、卵巢浆液性腺 癌等.特点是阳性颗粒靠近腔面,基底部可呈阴性反应.在肿瘤标记物中多见于上皮膜抗原、上皮特异性抗原、结肠相关抗原、卵巢癌抗原等,甲状腺腺癌中甲状腺球蛋白常以该形式出现, 复合型 常规免疫组化标记中,同一种抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞核和胞浆、微绒毛和胞浆,很少发现胞膜和胞
8、核同时表达.应注意组织标本固定不及时造成抗原移位,3.阳性标记组织学特征,根据免疫组化阳性细胞的组织学特点,免疫组化阳性细胞或阳性颗粒可呈以下类型排列:局灶型 弥漫型 片块型 网状型 腺管型 腔缘型 菊团型,4.阳性标记强度特征,细胞免疫组化标记的阳性强度根据显色程度分为弱阳性、阳性和强阳性;也可依据阳性细胞在细胞中所占比例大致分为:弱阳性,阳性细胞25%;阳性,阳性细胞25% 50%;强阳性,阳性细胞50%,5.非特异着色特征,下面情况可干扰免疫组化结果的观察和判断： （1）抗体交叉反应:是由于该抗原决定簇同 时存在于多种组织细胞，如GFAP可同时存在 于星形胶质细胞和唾液腺肌上皮.S-10
9、0蛋白 则更为严重,可表达于多种组织细胞.因此应 全面了解和认识该抗体的功能和标记范围,（2）肿瘤细胞异常表达:可选用多种标记证实或排除,鉴别其真正组织来源或向某一组织细胞分化 （3）肿瘤细胞吞噬组织抗原:某些恶性肿瘤细胞摄入周围正常组织细胞成分,虽然后者也存在某些抗原,但不属于瘤细胞固有成分,胞浆内抗原定位较模糊,因此应该区别,（4）非特异性染色:是指抗原无明确定位,细胞与间质均为黄色,相互累及一片,色度无深浅之分.常原因见为组织标本固定不佳、抗体质量问题或稀释度不合理及操作方法不规范等.免疫组化特异性染色定位非常重要,如果缺乏细胞间的不均一性染色即使阳性染色,常提示为非特异性染色.组织片边
10、缘反应和出血坏死灶周围阳性反应不能作为诊断依据,免疫组化结果的判断原则及 对假阴性和假阳性的认识,免疫组化结果判断原则 .必须设染色对照 每批染色都要以特异性阳性对照和阴性对照为基础.没有阳性对照 就不能做出真正阴性结果的判断;没有阴性 对照,也就不能做出真正阳性结果的判断. 没有对照的免疫组化结果是不可信的,抗原表达必须在特定部位 阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位,如LCA在细胞膜上、S-100蛋白在胞浆和胞核内,不在抗原 所在部位的阳性表达不能视为阳性 阴性结果不能视为抗原不表达 即阴性结果不能认为具有否定意义;阳性表达有强弱、多少之分,只有少数细胞阳性（在抗原所在部位）也要视为阳性
11、表达,引起假阴性和假阳性结果的原因,假阴性结果的原因主要是： （1）抗体已失活或浓度不当 （2）组织自溶(抗原扩散)导致抗原消失,特别 长期固定标本,应多用新鲜标本 （3）操作步骤不当,如反应时间不够或过久、 洗脱不够或温度过高 （4）组织或细胞中抗原的含量很低,假阳性结果的主要原因 （1）所用的抗体有交叉反应,特异性差，特 别应用多克隆抗体时更易出现 （2）所用抗体浓度过高或染色过程中切片 干燥导致抗体与组织产生非特异性结合 （3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、 碱性磷酸酶及生物素等产生非特异性 显色,免疫组化操作经验和体会,操作注意问题： 1.石蜡切片和冰冻切片均可,要注意防止脱片 2.
12、充分消除内源性过氧化酶和非特异性染色 3.PBS洗涤要充分 4.要设阴性和阳性对照 5.显色注意底物要适量、时间要严格控制,6. 消除内源性生物素活性:先以 0.01%抗生物 素溶液作用切片20min 7.ABC复合物应在临用前30min配置 8.ABC试剂保存温度为4 9.抗体保存：-20 分装冻存,或于4 常规使 用,切忌反复冻融,免疫组化常遇问题,1 .均匀的背景染色:酶-底物反应时间过长、孵育切片干燥、一抗或二抗稀释度不够、切片洗涤不充分、封闭用的正常血清不对 2 .部分区域背景着色:切片部分区域干燥、显色反应物在封片介质中可溶、造成弥散 3 .部分区域不着色:脱蜡不完全 、切片部分区
13、域干燥,4.各种孵育结果所有抗体均不着色 :H2O2终浓度不够或存放过久、稀释液中有错误的正常血清、显色反应物溶于脱水的酒精及二甲苯或封片液 5.某些抗体不着色:需要消化而没有消化、封闭内源酶时使抗体活性下降、切片在裱片或干燥时过热、抗体过度稀释、一抗浓度小于二抗、抗体过期或频繁冻融,6. 内源性酶活性:H2O2 -甲醇封闭不当 7. 脱片:切片无粘附试剂、切片不干净、组织 在贴片前已经充分固定 8. 核轮廓模糊:切片已干燥、苏木素染液欠佳 9 . 非特异性染色:底物未过滤、抗体未离心 10.阳性反应太弱:抗体或其它试剂活性下降、 显色反应时间过短、抗体的稀释度或孵育 时间不够、加抗体时切片上
14、缓冲液过多,11 .切片镜下模糊或黑点沉着:脱水不彻底、 进入二甲苯前加一步等量石碳酸/二甲苯 混合液、温箱干燥替代脱水过程, 免疫荧光标记技术,荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后,即刻引起发光,停止能量供给,发光亦瞬即停止.荧光素是一种能吸收激发光的光能产生荧光,并能作为染料使用的有机化合物,亦称荧光色素.目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(RB200)及四甲基异硫氰酸罗丹明(TMRITC),FITC:最大吸收光谱490-495nm, 最大发射光谱 520-530nm，黄绿色 RB200:最大吸收光谱570-575nm，最大发射 光谱595-600nm，橙
15、红色 TMRITC:最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，橙红色,基本原理 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合,以荧光素作为标记物,与已知的抗体(或抗原)结合、不影响其免疫学特性.将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原.在荧光显微镜下,可以直接观察呈现特异荧光的 抗原抗体复合物及其存在部位,荧光抗体染色方法 直接法:这是荧光抗体技术最简单和基本的方法.滴加荧光抗体于待检标本片上,经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察.标本中如有相应抗原存在,即与荧光抗体特异结合,在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物.此法的优点是简单、特异.但其缺点是检查每种
16、抗原均需制备相应的特异性荧光抗体,且敏感性低于间接法,间接法:首先将待测抗体加在含有已知抗原的标本片上作用一定时间冲洗;滴加标记抗抗体.如第一步中抗原抗体发生结合,加入的标记抗抗体和已固定在抗原上的抗体分子结合,形成抗原-抗体-标记抗抗体复合物并显示荧光.此法优点是敏感性高于直接法,缺点容易产生非特异性荧光,免疫荧光实验的注意事项 1.反应过程一定要避光,操作过程尽量避光 2.操作过程结束,尽快荧光显微镜下看结果 3.注意镜下结合荧光与非结合荧光的区别 4.每次实验应该提前激发荧光显微镜光源 5.使用荧光显微镜时间1-2h为宜, 荧光原位杂交（FISH）技术,荧光原位杂交（Fluorescen
17、ce in situ hybridization，FISH）是建立在核酸分 子杂交和放射性原位杂交基础上的非放 射性原位杂交技术，将标记的核酸探针 与细胞或组织中的核酸进行杂交,它是基于DNA探针序列与标本细胞中互补序列的特异碱基配对的原理,DNA探针经引入报道分子（如生物素或地高辛）的化学修饰后，可利用与特异报道分子结合物（如亲和素或直接抗报道分子的抗体）偶联的荧光染料加以检测。FISH技术可用于染色体的DNA检测、基因定位、转基因检测、染色体异常观测及疾病的诊断等众多领域,染色体荧光原位杂交始于细胞遗传学和DNA技术的结合,基础为Southern blot原理,以半抗原如生物素、地高辛间接
18、标记或以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交,互补的异源单链DNA 分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA,通过荧光标记在通过荧光显微镜观察杂交信号,荧光原位杂交优点 1. 快速灵敏、特异性好,可同时分析分裂期 和间期的多个细胞,并进行定量 2. 检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核 型 3. 使用多种荧光标记,显示DNA片段及基因 之间的相对位置与方向,空间定位精确,荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交 实验流程, 分光光度法,分光光度法是通过测定待测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度， 对该物质进行定性和定量分析的方法, 此法主要用
19、于核酸和蛋白质的定量检测,分光光度法常见用途： 1.核酸的定量 是分光光度计使用频率最高的功能.可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA以及RNA.最高吸收峰的吸收波长260 nm 2.蛋白质定量,染料结合比色法：在酸性条件下，考马斯亮兰 G-250 可通过疏水基与蛋白质分子的侧链基团结合呈兰色,在465595nm(最大吸收峰),随蛋白质含量不同，颜色在紫色到兰色之间变化，在一定范围内吸收值的大小与蛋白质浓度呈直线关系。,操作:取待测蛋白质样品0.1ml(100-1000 ug/ ml);加入稀释的显色剂5ml混匀室温10 min显色,测定其在595 nm的吸光度值(60 min内完成)
20、,制作标准曲线(1-10 ug),根据标准曲线求出待测样品蛋白质含量,常用的波长范围为： (1)200400nm的紫外光区 (2)400760nm的可见光区 (3)2.525m的红外光区 仪器： 紫外分光光度计、可见光分光光度计、红外分光光度计或原子吸收分光光度计,酶标仪使用方法: 1.打开主机及打印机电源开关,仪器进行 约30秒左右的自检,显示基础酶联 2.按测量模式,选择单波长检测,输入所需 波长(405、450、492、540、630nm),3.通过、选择有无试剂空白及空白孔 位置(单孔、列、列平均、行、行平均 ), 然后选择每板都带空白 4.机器回到主界面,添加打印纸,放置酶标板, 按
21、开始键,30秒左右检测完毕自动打印数 据,酶标仪使用注意事项: 1.先开主机电源,再开打印机电源 2.小心操作,以防将液体溅到机器上 3.酶标板放平,对好位置 4.用后关机并登记,分光光度计使用方法: 1.打开电源开关,机器约3分钟初始化 2.在机器主界面按goto键,设置所需波长，按 确认键 3.按shift/return键，进入系统设置界面，按 键选择样品池个数,4.设置样品池后,按shift/return键回到测量界面, 在1号样品池放入空白对照,按zero进行空白 校正 5.自动校零后,在2号样品池放入样品,按start键 进行测量 6.记录测量数据,退出程序,取出比色皿清洗干 净,分光光度计使用注意事项： 1.如测量中更换波长,要重新空白校正 2.及时记录测得数据,退出程序或关机后不保 存数据 3.每次测完后取出比色皿,清洗干净 4.用后关机登记,谢 谢！,