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1、第五章 糖基磷脂酰肌醇化蛋白及有关糖复合物,蛋白质锚定在膜表面的新方式,还记得脂筏吗？,膜蛋白的引渡船,脂筏的组成成分,脂筏（lipid raft）是质膜上富含鞘糖脂、GPI蛋白和胆固醇的微结构域（microdomain）。,蛋白质与膜表面的结合方式,1,2：整合蛋白 3,4： 锚定蛋白 5,6： 外周蛋白,糖基磷脂酰肌醇化蛋白,一类由蛋白质、脂质和糖链三者共价结合的复杂的糖复合物糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)化蛋白。,GPI蛋白的分布,1985年以锥虫表面抗原为例阐明其结构 GPI蛋白广泛存在于真核生物，包括原生动物、酵母、粘菌、无脊椎动
2、物等以及哺乳动物的血液、肝、肾、胎盘和脑等组织。 目前已发现近百种GPI蛋白，包括多种水解酶、细胞粘附分子、哺乳动物细胞表面抗原和受体、原虫抗原、补体调节蛋白、朊病毒等。,GPI化蛋白的种类和分布举例,GPI化蛋白的基本结构,蛋白质： C末端残基与GPI锚相连，通常为Gly、Ala、Ser、Cys、Asp、Asn。有些本身是糖蛋白。 磷酸乙醇胺桥 糖链: 接在肌醇磷酸的6位 共有的四糖结构：Man-Man-Man-GlcN 肌醇磷酸 插入脂双层内的长脂肪链： 脂酰甘油或甘油醚；极个别被神经酰胺取代。,GPI锚,GPI化蛋白的结构要点,结构组成 脂肪链与甘油的连接方式 糖链的修饰变化 糖链与肽链
3、的连接 极个别脂酰甘油被Ceramide代替,其它GPI有关糖复合物,存在于一些寄生性原虫表面： 脂肽磷酸聚糖 (LPPG) 糖肌醇磷酸聚糖 (GIPL) 脂磷酸聚糖 (LPG) 糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican),三种致命的原虫,布氏锥虫（ Trypanosoma brucei ）引起的非洲昏睡病在撒哈拉以南的非洲地区每年感染万人，如果得不到及时治疗，往往会“杀人于昏睡之中”。 枯氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起南美锥虫病，它由锥蝽叮咬人后排泄的粪便传播，在拉美地区每年导致万人死亡。 硕大利什曼原虫（Leishmania major）引起的黑热病蔓延大洲、多个国家，是
4、公共卫生的严重威胁。,锥虫(Trypanosomes)和昏睡症(Sleeping Sickness ),非洲昏睡病,锥虫寄生之谜,锥虫本身对抗体和补体高度敏感 它们却生活在布满免疫细胞的血液系统 它们可引发强烈的免疫反应 然而他们可以在同一宿主体内繁殖生活一年或更长，直至宿主死亡,the GPI anchor,GPI锚的加工是在翻译后立即添加的 蛋白质的C端疏水区作为信号肽，可被切除然后以转肽反应被糖脂取代，形成GPI化蛋白,锥虫表面的抗原变化,GPI锚可在锥虫表面形成高度密集的排列 锥虫表面于是形成由可变表面糖蛋白（Variant Surface Glycoproteins, VSGs）组成
5、的致密外壳 这种外壳与利氏曼原虫表面的脂磷（酸）聚糖 相当,锥虫的基因组与VSG,锥虫为单细胞真核生物，其染色体为二倍体。布氏锥虫含有100个小染色体和20个较大染色体，编码VSG的基因在各种染色体上都有。 锥虫基因组中的6-10%编码VSGs (more than 1000 genes) 根据在染色体上的位置分为内部VSG基因和端粒VSG基因，VSG基因的表达总是在端粒的表达位点（Expression site, ES）上进行。表达位点有多个，但一定时期只激活一个。 在特定时期只有一种VSG基因表达，而其他999种都被关闭 VSG基因表达的转换以很低几率发生，如果宿主产生了对前一种VSG的抗
6、体，则新的表达型就会迅速扩增起来 What is the advantage of expressing a single VSG? How is expression controlled? What mechanisms can you think of by which a cell could control gene expression and protein abundance?,Antigenic variation,所有的VSGs都是65 kDa的 GPI蛋白，在细胞表面呈二聚体 蛋白的外端高度可变，但Cys的位置保守 其他非可变蛋白如转铁蛋白受体或己糖转运体隐藏在表面外壳内
7、部,Antigenic variation,锥虫基因组中有1000个基因编码表面抗原 但每个特定时期只有一个VSG基因被表达 启动子调节？ 基因的位置？ 其他机制？,转座效应,Transposition of VSG genes occurs by intra- or intermolecular recombination This explains switching but not really why one gene is active and all the others are silent,碱基的稀有修饰,染色质修饰调控基因表达 实际上发现失活和激活部位的一种特殊修饰（标记为J
8、 (b-glucosyl-hydroxy-methyluracil)有差异 But is this a chicken or an egg?,GPI抗原的“漂移”？,在非洲锥虫病病人的红细胞膜上发现了锥虫的一种GPI蛋白表面抗原！ GPI锚介导蛋白质在细胞表面转移细胞表面工程 许多细菌、寄生虫毒性蛋白也是GPI蛋白，可把毒素转移给宿主细胞。如何抑制？,GPI化蛋白的生物合成,核糖体合成新生肽链,内质网腔,N-端去除1530aa信号肽,C-端去除1530个aa,肌醇磷酸,GPI锚,GPI化蛋白,细胞质,Biosynthetic pathway of GPI-anchor,Proteolytic
9、cleavage at w site Addition of preformed GPI anchor at C-terminus through an amide linkage to the ethanolamine of the GPI anchor Protein can be released by action of cell surface phospholipase,GPI = glycosylphosphatidylinositol: lipid modification that anchors proteins to the cell surface,GPI化蛋白运送到质
10、膜表面的方式,小窝蛋白,GPI化蛋白的降解,磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIP2),GPI蛋白,DAG,GPI化蛋白的生物功能,免疫及神经细胞活化： T细胞活化 神经细胞表面的N-CAM和CNTF受体 与信号转导：脂筏 作为受体 叶酸受体 墨素转铁蛋白(melanotransferrin),GPI蛋白锚定的优势,可能赋予膜蛋白的较大的横向运动性 通过激活脂酶介导蛋白质的释放和分泌 靶向膜蛋白使其定位于细胞表面特定的区域 通过内吞作用调节细胞表面蛋白质的周转 参与受体介导的传递跨膜信号,GPI锚定蛋白的鉴定,水解细胞膜表面蛋白的GPI锚 细菌中提取的PI-PLC 锥虫中的GPI-PLC 血清中GPI
11、-PLD 氢氟酸 稀亚硝酸 Western blot鉴定,GPI裂解位点,Enzymatic and chemical cleavage sites of GPI anchors useful in identifying GPI- anchored membrane proteins. (GPI-PLC) GPI-specific phospholipase C; (GPI-PLD) GPI-specific phospholipase D; (HF) hydrogen fluoride; (HONO) nitrous acid; (NaOH NH3) mild alkali treatme
12、nt with either sodium hydroxide or ammonia; (PI-PLC) phosphatidylinositol-specific phospholipase C.,GPI化蛋白与疾病和药物设计,阵发性夜间血红蛋白尿症 (PNH) GPI化蛋白与细胞表面工程 GPI化蛋白与抗感染药物设计 通过抑制GPI锚结合蛋白从膜上释放而抑制病原毒素向宿主的转移,GPI蛋白与细胞表面工程,体外GPI化蛋白可从一个细胞转移到另一个细胞表面 细胞表面工程的步骤： 把目的蛋白cDNA与GPI结合必需的C-端肽cDNA融合表达，即可形成新的GPI化蛋白。 提取蛋白质与靶细胞保温，G
13、PI蛋白即可自动组装到靶细胞上。,细胞表面工程的优点,制备较大量的GPI化蛋白 可在一些难以基因转染的细胞表面表达目的蛋白 可对细胞表面蛋白进行修饰 多种GPI蛋白可以同时结合在一个细胞表面,阵发性夜间血红蛋白尿症 (PNH),Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) ：成人发病率1/105106。 是一种获得性溶血性贫血，其病因是细胞膜上缺失十几种GPI化蛋白，如作为补体调节蛋白的衰变加速因子(DAF)和补体C8的结合蛋白等，使红细胞对补体敏感性增加而产生红细胞溶血。 缺陷在于GPI生物合成的第一步，即GlcNAc向磷酸肌醇转移这一步，相关的基因是磷
14、脂酰肌醇聚糖A(phosphatidylinositolglycan class A, PIG-A)基因。,Haemoglobinuria: Urine passed 7am is dark containing a large amount of free haemoglobin which leaks out of PNH red-cells as they burst. The urine generally clears during the day.,PNH患者的血尿症状,PNH机制,PNH的治疗,骨髓移植 补体抑制剂：Alexion制药公司(Cheshire, CN, USA)获得了美国食品药品管理局 (FDA)批准使用Soliris (eculizumab)治疗PNH患者以降低溶血。 扩增正常细胞：生长因子？ 25% of PNH patients survive 25 years - one half of these go on to spontaneous remission 将正常人红细胞释放的囊泡与PNH患者红细胞共置，回流。 造血干细胞基因治疗,思考题,GPI蛋白的结构组成？ GPI蛋白的生物合成过程？ GPI蛋白在细胞表面的锚定方式与糖蛋白相比有什么优势？ GPI蛋白的分布和主要生物功能 GPI蛋白在生物工程中的应用,