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1、免疫标记技术,第一节 免疫标记技术的基本概念,一、免疫标记与标记免疫的概念 二、常用的免疫标记物质,免疫标记与标记免疫,免疫标记技术： 标记物与免疫活性物质的联接技术 标记免疫技术： 以标记免疫物质检测相应靶物质的技术,常用的免疫标记物质,类别 标记物 用途 荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定 放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I 酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定 化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定 金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定,第二节 酶标记技术,一、常
2、用标记方法 二、标记免疫物的分离与鉴定,常用标记方法,1、常用酶 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 2、标记方法 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法,戊二醛交联法 (一步法）,抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶,抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶,抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体,酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶,戊二醛交联法（二步法）,COH-（CH2）3-COH + NH2-酶,抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶,抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = N
3、H2-酶,过碘酸盐氧化法,NaIO4,O,O,OH,+ NH2抗体,O,O,O,N,N,抗体,抗体,H2O,N,抗体,NaBH4,Schiff碱,酶-五炭糖环,标记免疫物的分离与鉴定,1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析 2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度,第三节 荧光标记技术,一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与纯化,常用标记方法,1、荧光素的概念 2、生物标记荧光素的要求 3、常用荧光素标记原理与方法,生物标记荧光素的要求,1、具有与蛋白质共价结合的能力 2、荧光效率高 3、能与背景物质形成鲜明对比 4、不影响蛋白质的生物、免疫活性 5、标记方法安全、简便 6、标记物稳定
4、，易保存,FITC的标记原理与方法,荧光素-N=C=S + NH2-抗体,荧光素-N-C-N-抗体,H S H,RB200的标记原理与方法,荧光素-SO3Na + PCl5,荧光素-SO2 Cl + PCl3 + NaCl,荧光素-SO2 Cl + NH2-抗体,荧光素-SO2 -NH-抗体 + HCl,标记免疫物的分离与鉴定,1、分离 目的：去除游离荧光素 方法：柱层析 2、鉴定 抗体活性 标记物结合度 F/P比值的应用意义,第四节 放射性核素标记技术,一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与纯化,常用标记方法,1、常用放射性核素 2、125I 的标记方法 直接法（氯胺T法） 间接法（连接法
5、）,直接法（氯胺T法）,Na125I 4。C,125I,氯胺T,间接法（连接法）,+ Na125I,氯胺T,125I,NSHPP,间接法（连接法）,CH2,OH,H-C-C-N-蛋白质,H O H,+ NH2-蛋白质,125I,125I,标记免疫物的分离与鉴定,1、分离 目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析 2、鉴定 游离放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）应用意义,本章小结,1、免疫标记技术的概念 2、常用免疫标记物质及其标记方法 3、标记免疫物质的分离与鉴定,思考题,1、何谓免疫标记技术？ 2、常用的免疫标记物质有哪些？ 3、酶标记的主要方法有哪些？ 4、F/P比值的实用意
6、义如何？ 5、何谓比放射性？有何意义？,标记免疫技术的应用,第一节 标记免疫技术的分类,一、按指示标记物质划分的类型 二、按测定方式划分的类型 三、按测定用途划分的类型,1、酶免疫技术 2、荧光免疫技术 3、放射免疫技术 4、发光免疫技术 5、金免疫技术,按指示标记物质划分的类型,1、均相型（homogenous） 2、非均相型（heterogeneous）,按测定方式划分的类型,均相型（homogenous）,非均相型（heterogeneous）,双标记均相荧光免疫测定,酶扩大免疫测定技术,1、免疫测定技术 2、免疫组化技术,按测定用途划分的类型,第二节 酶联免疫吸附试验,一、ELISA技
7、术的原理与方法 二、 ELISA技术的操作注意要点,ELISA技术的原理与方法,间接法 夹心法 竞争法,间接法,夹心法,竞争法,酶标仪,酶标仪,ELISA技术的操作注意要点,试剂器材 操作环节 合适工作浓度,第三节 荧光抗体技术,一、荧光抗体技术的原理与方法 二、荧光抗体技术的操作注意要点,荧光抗体技术的原理与方法,直接法 间接法 补体法 双标记法,直接法,间接法,补体法,双标记法,荧光抗体技术的操作注意要点,标本处理 染色操作 结果观测,荧光显微镜,荧光显微镜使用原理,激发滤片（BG）,吸收滤片（OG）,标本,FITC吸收光峰值：490-495nm FITC发射光峰值：520-530nm B
8、G：325-500 OG：410-650,激发滤片,吸收滤片,荧光滤镜使用原理,第四节 放射免疫测定技术,一、放射免疫测定技术的原理与方法 二、放射免疫测定技术的操作注意要点,结合相,游离相,放射免疫分析法的原理与方法,1 2 5 10 20 50 100,40 30 20 10,未标记抗原含量,结合、游离相放射性含量比值,液闪仪,计数器,放射免疫测定技术的操作注意要点,反应的温度与时间 结合相与游离相的分离,免疫标记技术的比较,FIA ELISA RIA 敏感性 较低 高 高 特异性 高 高 高 重复性 差 好 好 检测对象 Ag/Ab Ag/Ab Ag,本章小结,1、标记免疫技术的类型 2、ELISA技术的原理与方法 3、荧光抗体技术的原理与方法 4、RIA技术的原理与方法,思考题,1、如何区别均相型与非均相型的测定方式？ 2、ELISA分几种类型，各有哪些特点？ 3、适于标记的荧光素应符合哪些要求？,