第一部分概述第二部分血脂脂蛋白及载脂蛋白测定.ppt

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1、第十章 血脂及血浆脂蛋白检验,第一节 概 述 第二节 血脂、脂蛋白 及载脂蛋白测定,一、血脂和血浆脂蛋白 自学 二、脂蛋白代谢紊乱 （一）高脂蛋白血症 血脂含量超过正常称为高脂血症，由于血脂均以血浆脂蛋白的形式存在，故也称为高脂蛋白血症。按发病原因分为两大类。 1.按表型分类 以Fredrickson（1967）分类法为基础，经WHO（1970）修订的分类系统，根据血清TC、TG、外观和脂蛋白电泳图谱，将其分为6型。,第一节 概 述,（1）型高脂蛋白血症 又称高乳糜微粒血症。是一种常染色体隐性遗传病。由于LPL缺损或LPL活化因子（ApoC）缺损所致。婴儿期即可发生，但罕见。其生化检查特征：

2、4冷置试验，血清上层为奶油状，下层清亮。 血清TG，达11mmol/L以上，血清TC正常或轻度。 血清LPL活性。 血清脂蛋白电泳，CM。,（2）a高脂蛋白血症 又称高-脂蛋白血症或高胆固醇血症。属常染色体显性遗传，有明显的家族史。病因LPL受体缺损，杂合子型发生频率为1/500，纯合子型发生频率为1/100000。其生化检查特征： 4冷置试验，血清外观清亮透明。 血清TC，15.6mmol/L尤其是LDL-C，TG正常。 血清脂蛋白电泳，-LP。 临床表现，中青年常伴有冠状动脉硬化，结局为心肌梗塞。,（3）b型高脂蛋白血症 在a型基础上伴有VLDL（高LDL+VLDL血症），病因不明。其生化

3、检查特征： 4冷置试验，血清外观清亮或微混。 血清TC，TG。 血清脂蛋白电泳，-LP，pre-LP。,（4）型高脂蛋白血症 又称宽-脂蛋白血症。属常染色体显性遗传病，发病率1/10000，病因，ApoE异常，与相应受体结合率。其生化检查特征： 4冷置试验，血清外观混浊，后形成蜡样黄色薄膜。 血清TC，TG。 血清脂蛋白电泳，-LP，pre-LP，IDL。融合形成宽区带。,（5）型高脂蛋白血症 又称高前-脂蛋白血症或家族性高甘油三脂血症。属常染色体显性遗传病，较常见，我国原发性高脂蛋白血症中一半属于此型。病因，ApoA2异常。其生化检查特征： 4冷置试验，血清外观混浊。 血清TG，TC正常或稍

4、。 血清脂蛋白电泳，pre-LP。 临床表现，多见于中年人易发生冠心病。,（6）型高脂蛋白血症 属常染色体显性遗传病，病因不详，可能由几种遗传缺陷所致，较罕见。生化检查特征： 4冷置试验，血清上层为奶油状，下层混浊。 血清TG，TC。 血清脂蛋白电泳，CM，pre-LP。,2.按是否继发于全身性疾病分类 分为原发性和继发性高脂血症。常继发于糖尿病、肝病、肾病、肥胖以及过量饮酒，成人发病率为3%5%。 3.高脂血症的基因分型法 一部分高脂血症患者存在单一或多个遗传基因的缺陷，具有明显的家族聚集性，有明显的遗传倾向。,（二）低脂蛋白血症 主要有四种类型 1.低LDL血症 是一种常染色体显性遗传病，

5、病因ApoB100低下，血浆LDL减少，TC。 2.无LDL血症 罕见的常染色体隐性遗传病，病因ApoB100、B48缺损，血浆中无LDL，TC。 3.低HDL血症 病因不详，血清TG，动脉粥样硬化、冠心病的发病率高。 4.无HDL血症（Tangier病）罕见的常染色体隐性遗传病，ApoA、A缺损，血浆TC，HDL-C。,血脂测定方法很多，目前临床实验室基本检验项目有：血清外观分析，TC，TG，HDL-C，LDL-C测定。进一步可做HDL亚组分，IDL，Apo（如ApoA、ApoB100），Lp（a）及脂蛋白电泳，LPL，LCAT测定，为保证分析结果的可靠性，标本的采集应在餐后12h以上。,第

6、二节 血脂、脂蛋白及载脂蛋白测定,一、血清外观分析（血清冷置试验）,二、血清总胆固醇测定 胆固醇是人体重要的脂类成分，具有重要的生理功能，如合成类固醇激素，维生素D3胆汁酸，并构成细胞膜成分，TC包括FC（1/3）和CE（2/3），胆固醇与动脉粥样硬化有密切关系，故胆固醇测定是最常用的实验室检测项目之一。 TC测定方法很多，约200多种，分为化学测定法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法（决定性方法）。,（一）化学测定法 主要有两类 1.Liberman-Burchard反应 简称L-B反应，胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成3.5-胆烷二烯阳离子，然后被醋酐，浓硫酸氧化生成绿色的胆

7、烷六烯磺酸。呈色稳定性差。 2.Zak反应 胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成3.5-胆烷二烯阳离子，然后在Fe3+存在下氧化生成紫红色胆烷四烯阳离子，灵敏度较L-B反应高7倍，且呈色稳定性好，但试剂腐蚀性极大，不能用于自动化分析。,（二）酶法 胆固醇酯 胆固醇 脂肪酸 胆固醇 O2 胆烷-4-烯-3酮 H2O2 H2O2 4AAP 酚 红色亚胺醌 H2O,CEH,ChOD,POD,试剂中除上述三种酶外，还有胆酸钠和表面活性剂及稳定剂，胆酸钠用于激活CEH，表面活性剂促进胆固醇从脂蛋白中释放。 酶法操作简便，快速，试剂无腐蚀性，适合于自动化分析，但也存在有一些不足，CEH对胆固醇水解不完全，表面活

8、性剂影响CEH活性，黄疸血清中过高的胆红素可还原H2O2使结果偏低。,【参考范围】3.105.70mmol/L 【临床意义】血清TC含量受年龄、性别、饮食和运动等因素的影响。20岁以上随年龄而，70岁以后则有下降趋势。2040岁阶段男性高于女性，但女性绝经后则高于男性。城市人群高于农村人群，与饮食和运动有关。脑力劳动者高于体力劳动者。 病理性高胆固醇血症 原发性高胆固醇血症，糖尿病、胆道阻塞、肾病综合症、甲状腺功能减退。 病理性低胆固醇血症 严重贫血、甲亢、营养不良。,三、血清甘油三脂测定 TG是有一分子甘油与三分子脂肪酸组成的化合物，主要存在于VLDL和CM中，临床化学中往往以测定甘油代表T

9、G的含量。TG的测定方法很多，如气相色谱法、高效液相色谱法、红外分光光度法。但上述方法需特殊的仪器设备和技术，故一般只用于研究工作中。临床实验室主要用化学法和酶法。,（一）化学法 基本步骤可归纳为四步 1.提取：甘油三脂的提取 采用合适的溶剂，使脂蛋白变性提取TG，同时去除干扰物质(磷脂、游离甘油、葡萄糖等),常用方法有： （1）异丙醇抽提，沸石合剂（沸石、高岭土）吸附。 （2）异丙醇抽提，氧化铝吸附磷脂。 （3）正壬烷、异丙醇、稀硫酸分溶抽提，免去吸附磷脂的操作，后用价廉的正庚烷代替正壬烷。应用较广。,2.皂化：甘油三脂的水解 一般都采用KOH乙醇或KOH异丙醇溶液，60，515min可使T

10、G完全水解。 3.氧化：甘油的氧化 最常用的氧化剂是HIO4，甘油在酸性条件下被氧化成甲醛、甲酸。反应受-磷酸甘油、葡萄糖、丝氨酸的干扰，故抽提时应尽量除去此类物质的干扰。,4.显色：显色测定甲醛。常用方法有： （1）甲醛与变色酸（4.5-二羟-2.7-萘二磺酸）在硫酸溶液中加热生成紫红色化合物。（570nm） （2）甲醛与乙酰丙酮在氨的存在下缩合成黄色的3.5-二乙酰-1.4-二氢-2.6-二甲基吡啶。（420nm）,（二）酶法 常用的有： 1.磷酸甘油氧化酶法（GK-GPOD-POD法） TG H2O 甘油 FA 甘油 ATP 3-磷酸甘油 ADP 3-磷酸甘油 O2 磷酸二羟丙酮 H2O

11、2 H2O2 4-AAP 酚 红色亚胺醌 H2O 试剂较稳定，灵敏度高，线性范围宽，胆红素、维生素C可消耗H2O2使结果偏低。,LPL,GK,GPOD,POD,2.乳酸脱氢酶法（GK-PK-LDH 法） TG H2O 甘油 FA 甘油 ATP 3-磷酸甘油 ADP ADP 磷酸烯醇式丙酮酸 ATP 丙酮酸 丙酮酸 NADHH+ 乳酸 NAD+ 3.甘油氧化酶法 第一步消除血清中原有的甘油：,LPL,GPOD,PK,LDH,游离甘油 O2 甘油醛 H2O2,GlyOD,H2O2 EMAE 无色物质 EMAE称N-乙基-N-（3-甲基）-N-乙酰乙二胺。是一种还原剂，灵敏度比酚高。第二步测定甘油三

12、脂水解释放的甘油： TG H2O 甘油 FA 甘油 O2 甘油醛 H2O2 H2O2 4-AAP EMAE 有色化合物,POD,GlyOD,LPL,POD,【参考范围】0.561.70mmol/L 【临床意义】血清TG一般随年龄增长而升高，体重超标者往往偏高。 1.病理性增高 原发性高脂蛋白血症、肥胖症、糖尿病、肾病综合症、脂肪肝、妊娠后期。 2.病理性降低 甲亢、肾上腺皮质功能减退、严重肝功能损伤。,四、血清（浆）脂蛋白测定 （一）血清脂蛋白电泳 临床实验室常用的支持介质有醋酸纤维薄膜和琼脂糖凝胶。 1. 血清脂蛋白醋酸纤维薄膜电泳 以醋酸纤维薄膜为支持介质，血清脂蛋白经电泳分离，然后用臭氧

13、氧化，使脂蛋白中的不饱和脂肪酸的双键断裂生成醛，再用亚硫酸品红染色，即生成紫红色区带。,2. 血清脂蛋白预染琼脂糖电泳 血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，进行电泳分离，即可得到清晰的兰色区带。 凝胶浓度一般为0.5%，超过1%，-Lp与pre-Lp不易分开，0.5%，凝胶机械强度太低。 血清：染料为9：1，染料过多稀释标本，而且染料中乙醇会引起蛋白质变性，影响分离效果。,结果判断，直观区带的着色深浅，宽窄，用浅染，稍浅染，深染及消失加以描述；或用光密度扫描仪测定。 【参考范围】 -Lp 30%40% pre-Lp 13%25% -Lp 50%60% CM （）,（二）血清

14、高密度脂蛋白测定 常以测定HDL-C含量代表HDL水平。测定步骤包括HDL的分离；测定HDL中胆固醇。 HDL的分离方法有：超速离心法、凝胶过滤法、免疫化学法、电泳法、沉淀法。临床实验室常用沉淀法。沉淀剂一般为二价阴离子和多价阴离子。如：肝素-Mg2+、硫酸葡聚糖- Mg2+、磷钨酸- Mg2+、聚乙二醇（PEG）等。,如：磷钨酸- Mg2+选择性地沉淀血清中的LDL和VLDL，经离心上清液中保留HDL，然后用酶法测定上清液中的胆固醇含量，即代表HDL中的胆固醇。 【参考范围】男 1.280.33mmol/L 女 1.370.33mmol/L 【临床意义】HDL-C与冠心病发病呈负相关，HDL

15、-C低于0.9mmol/L是冠心病危险因素。,（三）血清高密度脂蛋白亚组分测定 HDL有三个亚类（HDL1、HDL2、HDL3）最近的研究工作表明，HDL2亚类与冠心病危险度的相关程度比总HDL-C更密切。 HDL2 d = 1.0631.125g/ml HDL3 d = 1.1251.210g/ml HDL2脂类60% 蛋白质40% ；HDL3脂类45% 蛋白质55%,高密度脂蛋白亚组分的分析方法有超速离心法、柱层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、多价阴离子分级沉淀法。 其中多价阴离子分级沉淀法具有快速、经济、简便更为实用，是目前临床实验室最常用的方法。常用的沉淀剂有硫酸葡聚糖- Mg2+、聚乙二

16、醇（PEG）。,【原理】用PEG做沉淀剂，以不同浓度的PEG在不同pH条件下分别将VLDL和LDL（沉淀剂 95g/L PEG，pH6.5）HDL2（沉淀剂 170g/L PEG，pH7.5）沉淀，上清液中只含有HDL（沉淀剂）和HDL3（沉淀剂），然后用酶法测定HDL-C和HDL3-C，并以HDL-C减去HDL3-C的差即为HDL2-C的含量。 【参考范围】 HDL2-C 男 0.530.17mmol/L 女 0.620.22mmol/L HDL3-C 男 0.750.17mmol/L 女 0.750.16mmol/L,（四）低密度脂蛋白测定 低密度脂蛋白水平通常以LDL-C含量表示。LDL

17、-C测定方法很多，常用的有： 1. Friedewald公式法 LDL-C TCHDL-C 式中的浓度单位是mmol/L，在一般情况下能得到可被临床接受的近似结果，但TG4.25mmol/L时不能应用此公式计算，否则结果偏差太大。,2.聚乙烯硫酸盐沉淀法 聚乙烯硫酸（PVS）能选择性沉淀血清中LDL，再以血清TC减去上清液（含HDL和VLDL）胆固醇，即得LDL-C值。试剂中加入EDTA去除两价阳离子，避免VLDL共沉，辅以聚乙二醇独甲醚（PEGME）可加速沉淀。 3.直接测定法 匀相的LDL-C直接测定法是以不同的表面活性剂的双试剂使非LDL-C与LDL-C分两步水解，因先消除非LDL-C，

18、故也称为消除法。,【参考范围】LDL-C3.12mmol/L 【临床意义】LDL-C增高是动脉粥样硬化发生发展的主要危险因素。 （五）脂蛋白（a）测定 脂蛋白(a)是由载脂蛋白(a)与载脂蛋白B100通过二硫键连接所形成的特殊蛋白。脂蛋白(a)测定的方法目前常用的是ELISA法。 血清中的脂蛋白(a)与单克隆抗Lp(a)抗体结合，再与过氧化物酶结合，形成Lp(a)-单克隆抗体-酶复合物，然后与底物孵育显色。,【参考范围】120180mg/L 【临床意义】Lp（a）动脉粥样硬化、冠心病的独立危险因素，与动脉粥样硬化成正相关，血清Lp（a）浓度300mg/L时，其冠心病的发病率高于健康人的25倍。

19、血清Lp（a）水平主要决定于遗传，个体间Lp（a）水平差异很大，但同一个体血浆Lp（a）水平的变化较小，环境、饮食、药物对它的影响不明显。,五、血清载脂蛋白A及B测定 脂蛋白中的蛋白质部分称为载脂蛋白（apolipoprotein，Apo），可分为A、B、C、D、E、F、G、H八类，其中ApoA，B，C还有亚类。 ApoA是HDL的主要蛋白质，占HDL蛋白质的85%左右，它的血清浓度可代表HDL水平，ApoB是LDL的主要蛋白质，占LDL蛋白质的97%左右，ApoB浓度主要反映LDL水平。,Apo的测定方法主要有三类：层析分离，然后再按一般蛋白质定量；电泳分离后经染色光密度扫描定量；各种免疫分

20、析法。 层析法操作麻烦，一般只用于研究；电泳法简便灵敏，但各类Apo染色性能不一致，重复性不好；免疫法特异性好，灵敏度高，不需预先分离脂蛋白，适合临床实验室的应用，但需特异抗血清。,目前常用的免疫学方法有： 1.单向免疫扩散法（RID） 方法简单，但需时间长，灵敏度较低。 2.火箭免疫电泳法（IE） 比RID快速、灵敏，抗血清用量少。 3.免疫比浊法 测定抗原抗体复合物形成而产生的混浊，方法简便、快速，适合于自动分析仪，灵敏度高于火箭电泳法，免疫比浊法又分为：散射比浊法和透射比浊法。,4.酶联免疫吸附法（ELISA） 需制备指示酶与Apo或其抗体的交联物（现有商品化试剂盒）和酶标仪。 5.放射免疫法（RIA） 用核素标记抗原作为示踪物，灵敏度可达35g。 6.荧光免疫分析法（FIA） 7.化学发光免疫法（CLIA）,【参考范围】Apo A 1.001.50g/L Apo B 0.801.00g/L 【临床意义】 Apo A是HDL的主要结构蛋白， Apo B 是LDL的主要结构蛋白，因此，Apo A和Apo B 可直接反映HDL和LDL的含量。但在某些病理情况下， Apo A与HDL和Apo B与LDL并非成正相关，临床上常将 Apo A和Apo B 比值作为冠心病的危险指标。,