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1、2-1 DNA超螺旋与拓扑异构现象,第二章 DNA、染色体与基因组,Superhelix of SV40 DNA (Vinograd, 1965),一、 DNA超螺旋（superhelix or supercoil）,DNA超螺旋结构,Linear DNA. L,Open Circle DNA OC relexed form,Supercoiled circle(高级结构) Covalent Closed Circle CCC,指双螺旋环状分子再度螺旋化即成为超螺旋结构。,超 螺 旋 形 成 示 意,末端固定的线型双螺旋,额外的张力不能释放 双螺旋以扭曲方式缓 解应力，形成超螺旋,二、 DNA
2、超螺旋的方向性,松弛（relaxed）状态： DNA在水溶液中, 构型偏B型状态。DNA以10.5 bp/helix为最稳定构型。,正超螺旋：小于10.5bp/helix，则其二级结构处于紧缩状态，由此产生的超螺旋为正超螺旋。,负超螺旋：大于10.5bp/helix，则其二级结构处于松缠状态，由此产生的超螺旋为负超螺旋。,由此可见，超螺旋总是要向着抵消初级螺旋改变的方向发展；双螺旋DNA的松开导致形成负超螺旋；而DNA的拧紧，则导致形成正超螺旋；所有的超螺旋都比松弛型含有更多的自由能。,拓扑学(topology)是研究几何图形在平面位置关系不变情况下空间结构变化规律的数学分支。,三、DNA超螺
3、旋拓扑学定义,实验证明，细胞内的DNA存在拓扑异构现象(topoisome)，即在保持DNA一级和二级结构不变的情况下，两条单链可以相互缠绕，形成不同的空间构型。,超螺旋发生的规律,Vinograd. J (1968),Vinograd equation,L Linking number ( 双链DNA的交叉数),T Twisting number (双链DNA的缠绕数，初级螺旋圈数，即DNA分子中的Watson-Crick螺旋周数，其数值可直接在处于最稳定状态下的双链环形（或超螺旋形式）DNA中的实际螺旋周数计数得到，不一定是整数),W Writhing number (直观上为双螺旋数,
4、可为小数),Non-breaking Non-unwinding Non-overwinding,L为定值，整数,l B-DNA是力学上稳定的结构（ 10 bp/ helix）,l 虽交叉数减少，但需转换为一种应力，以维持10bp/helix的螺旋数，,l 应力的重新分配 或在B-DNA状态中保留一单链区,或螺旋力将维持B-DNA的右旋结构, 形成超螺旋,420bp,L=42 T=42 W=0,无应力松弛状态,应力的分配,L = 36 T = 36 W = 0,L = 36 T = 42 W = -6,松开6圈螺旋 L = 6,2比连系差（Specific linking difference
5、）, =,=,能够根据DNA分子Lk的改变描述螺旋不足（超螺旋），也叫超螺旋密度（superhelix density）。,DNA分子形成超螺旋的生物学意义： 1 超螺旋DNA具有更紧密地形状，因此在DNA组装中具有重要作用； 2 DNA的结构具有动态性，DNA超螺旋程度的改变介导了这种结构的变化，这有利于其功能的发挥。 3 DNA是一种热力学上的稳定结构，超螺旋的引入提高了他的能量水平。,拓扑异构体(topoisomer)：具有不同连接数的同一种DNA分子称为DNA拓扑异构体。,四、DNA拓扑异构体与拓扑异构酶,拓扑异构酶(topoisomerase) 作用方式： 拓扑异构酶与DNA共价结合
6、形成中间体，使磷酸二酯链暂时断裂形成切口，DNA分子的一条单链或双螺旋穿越另一条单链或双螺旋，改变其拓扑状态，但一级和二级结构并无变化。,即在保持DNA一级和二级结构不变的情况下，两条单链可以相互缠绕，形成不同的空间构型。,拓扑异构酶(topoisomerase) 细胞内存在着一类能催化DNA拓扑异构体相互转化的酶，称为拓扑异构酶。或者说，能改变DNA拓扑联系数的酶就叫拓扑异构酶。,型酶在两条单链上都产生切口，每次作用使连接数改变2。在型酶的作用是增加负超螺旋数，或减少正超螺旋数，在真核生物中还有减少负超螺旋的作用。,拓扑异构酶分为型和型两类。,拓扑异构酶的生物学功能 消除DNA复制和转录等过
7、程产生的正负超螺旋。在细胞中，型酶与型酶的活性保持一种平衡状态，型酶使DNA超螺旋化的作用为型酶使DNA松驰化的作用所抗衡，从而使DNA保持适当的超螺旋密度。,型酶在DNA的一条单链上产生切口，使另一条单链得以穿越，每作用一次使DNA连接数改变1；原核生物中，型酶只作用于负超螺旋DNA，减少负超螺旋数，使其松弛；在真核生物中，型酶还可以作用于正超螺旋DNA，减少正超螺旋数。,Top I (swivelase, niking-closing enzyme),Breakage & rejoining of S.S. DNA at phospho-diester bonds,每次L of +1（在酶
8、的作用下，DNA单链断裂）,松弛B-双螺旋,消除负超螺旋,CCC OC only No ATP, NAD,图3.30 型拓扑异构酶作用机理,Function Mechanism of Topoisomerase I,Top II (gyrase) ATP needed,Cutting & ligation of D. S. DNA,tetramer,Function Mechanism of Topoisomerase II,2-2 基因和基因组,一、基因、基因组的概念 二、基因组的大小与C值矛盾 三、基因组的复性动力学 四、重复序列 五、真核与原核生物基因组比较,指DNA分子所携带遗传信息总
9、和，即指一个细胞所有基因和基因间DNA的总和，称基因组。遗传学定义为：一个物种的单倍体的染色体的数目为该物种的基因组。,在真核生物中，每种生物的单倍体基因组的DNA总量是恒定的，称之为C值。,一、基因、基因组的概念,产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列，在遗传学上也称顺反子（cistron）。,(二)基因组,(三)C值,一个单倍体基因组中DNA的总量,(一)基因,C value paradox of nucleotide,A 生物体进化程度高低与C值的相关性不强,B 亲缘关系相近的生物C值相差较大,低等生物单倍体基因组DNA的含量与生物复杂性呈正相关，但高等生物这种关系并不一致。,
10、真核生物 DNA 染色体数 （2C） （2N） 两栖鲵 168.0 pg 24 肺鱼 100 38 蝾螈 85.3 24 警蛙 28.2 24 牛 6.4 60 人 6.4 46 绵羊 5.7 54 果蝇 0.2 8 贝母 196.7 24 豌豆 28 12 玉米 11 20,原核生物 DNA （C） Salmonella 0.0143 pg (沙门氏菌) E.coli 0.0040 T2 0.00022 0.0000055 174 0.000005,这种形态学的复杂程度与C值大小的不一致称为C值矛盾。,三、基因组的复性动力学,Hydroxyapatite column 羟基磷灰石柱,Low
11、C of P,High C of P,release D.S. DNA,absorb D.S. DNA,复性发生的过程的讨论,dCt / dt = -KC2,反应初始 t = 0,单链DNA的随机碰撞 过程（ randomly collision ）（二级反应动力学）,单链 DNA浓度 = C0,反应达 t 时,单链DNA浓度 = Ct,两条部分同源(小于20dNt)的S.S. DNA, 在复性过程中形成的部分双链区是不稳定的,dCt / dt = -KCt2 积分,Ct / C0 = 1 / 1+KC0t,当 Ct / C0 = 1/2 时,Ct / C0 = 1/2 = 1 / 1+ KC
12、0t(1/2),K = 1 / Cot(1/2),Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L),任一DNA分子达到 Ct / C0 = 的速率是定值,0,1,0,1,C0t(1/2) C0t(1/2),Fraction reassociated,在控制反应条件相同的前提下, 两种DNA分子的C0t(1/2)值,取决于dNt 的排列复杂性 。,AAAAAAAA K. C. = 1 C0t(1/2) = 210-6,ATCGATCGATCG K.C. = 4 K.C. = 5 105 C0t(1/2) = 1,( 复性动力学的复杂性，Kinetic complexity，K.C ),
13、Eukaryotic genomes have several sequence components,变性程度 部分变性的DNA可直接通过拉链作用迅速复性，而完全变性的DNA一般需要几个小时才能复性。,除温度、离子强度、pH等变性条件外，影响复性的因素有：,DNA的浓度 浓度越大有效碰撞的频率越高。,DNA分子大小 越小的分子复性越快。,DNA复杂性(complexity) 指最长的没有重复序列的核苷酸对数之和。,ATATATATATAT的复杂性为2； ATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGC的复杂性为4； ATGCATGCCTCAGTATGCATGCATGC的复杂性
14、为10； ATGCTGACGTAGCA的复杂性为14。,序列复杂的DNA更容易发生非对应配对，所以复杂性越高的DNA复性越困难。,3.高度重复序列（Highly repetitive sequence）,四、重复序列,单一序列（Unique sequence）,主要是蛋白质编码基因。,2.中度重复序列（Moderately repetitive sequence）,包括rRNA、tRNA、组蛋白的编码基因。研究较多的是Alu家族。,长度不到10bp，多是串联集中分布，一般不转录。有些AT含量很高的高度重复序列，在离心时常会在主要的DNA带的上面有一个次要的DNA带相伴随，这就是所谓的“卫星DN
15、A”,着丝点（centromere）功能必需的DNA序列约130bp长，并富含A=T碱基对；在着丝点附近，还有高度重复的卫星DNA。 端粒（telomere）顺序长约100bp，起到稳定染色体的作用。是由： 5(Tx Gy)n x约为14 3(Ax Cy)n y约为18,反向重复序列（Inverted repetitive sequence）,又称回文序列（Palindrome）,易形成发夹结构，在DNA双链中可能形成十字形结构。 CATGAACGTCCTATTGTCGGACGTTCTGA GTACTTGCAGGATAACAGCCTGCAAGACT,基因家族：真核生物基因组中有许多来源相同、结
16、构相似、功能相关的基因，这样一组基因称为基因家族。,（4）有些可以编码蛋白质，在某些基因的转录中作为调控成分。,五. 断裂基因（split gene）,也叫不连续基因，指在真核生物中，大多数编码蛋白质的基因是不连续的，即基因的编码序列之间插入了不编码的序列，称为断裂基因。,内含子的意义：,（1）可能是遗传的残留物。,（2）Walter Gilbert假说：是使蛋白质进化过程的残迹。,（3）可以保护基因家族中基因的完整性。,五、真核与原核生物基因组比较（ P78 ）,作为总结性的问题，课后总结。同时掌握 断裂基因、假基因、内含子、外显子的概念。,2-3染色体,2-3染色体,一、组成,1. 核小体
17、（nucleosome）：染色质是由重复单位构成的，每个重复单位由约200bp的DNA和H2A、H2B、H3、H4各两分子组成，这个重复单位叫核小体。,2. 组蛋白（histone） 五种： H1、H2A、H2B、H3、H4。呈碱性。 除了H1以外，其余四种有相互作用形成聚合体的趋势。它们通过C端的疏水氨基酸相互结合，而N端的碱性氨基酸则向四面伸出以便与DNA分子相互作用。,3.构成： 每个核小体含8个组蛋白；200bp DNA中，146bp 紧紧缠绕着组蛋白，其余用于连接两个核小体，称为连接DNA（linker DNA）。H1通常和连接DNA相结合，把核小体“封锁”起来。,4. 核小体包装的
18、高级形式,（1）核小体（压缩比为7，200bp长为68nm，压缩后为10nm ） （2）30nm的核小体纤维（30nm fiber，压缩比为40）。（3）染色体DNA的某一部分和“核骨架”（nuclear scaffold）相连，把染色体DNA隔成许多含20000至100000碱基对的DNA环。 （4）约6个环与核骨架形成一个梅花结，每30个梅花结形成一盘。一条染色单体大约有10盘。,4. 核小体包装的高级形式,染色体模型基于的原理： 真核染色体DNA包装好象是一次缠绕再接一次更高级的缠绕。即在螺旋上形成螺旋，再形成螺旋。,名词解释 DNA的拓扑异构体，DNA拓扑异构酶，基因，基因组，C值，C
19、值悖理，卫星DNA，基因家族，断裂基因，内含子，外显子，假基因，核小体 判断： 1.DNA拓扑异构酶能够切开DNA的1条链，而DNA拓扑异构酶能同时切开DNA的2条链，但都可以使DNA产生正向超螺旋。 2.人是最高等生物，其基因组的碱基对数目是生物界中最大的。 3.端粒酶是一种逆转录酶（反转录酶），它含有富G的RNA模板。 4.Cot1/2是与基因组的大小成反比的。 5. 从中看出在不存在重复序列情况下，C0t1/2值与基因组大小成正比，C0t1/2值是可以作为衡量一个基因组大小的尺度。 6. 多倍体只是导致基因组大小的增加，但没有引起有机体复杂度的增加。 7. 一个DNA分子的C0t1/2值越大，表明它的复杂度越高。 简答： DNA分子形成超螺旋的生物学意义。 比较真核与原核基因组结构特点。说明着丝粒与端粒属于哪种序列？ 如果一段DNA序列的两端为反向重复序列，若发生同源重组将会产生什么结果？,