实验-常规仪器的使用.ppt

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1、生物化学与分子生物学 实验技术,20年代： 微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等的发现。 瑞典著名的化学家T.Svedberg奠基了“超离心技术的理论基础，1924年制成了第一台5000 RCF的离心机（5000 r/min-8000 r/min，相对离心力“RCF”的单位可表示为“g”)，并准确测定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，获得了1926年的诺贝尔化学奖。,1. 1 生物化学实验技术发展简史,30年代： 电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看到细胞内的结构和某些生物大分子的大致结构。 美国哈佛大学的Folin教授和中国的吴宪教授建立了不少生物化学常用的分析方法如血糖分析、蛋白质含

2、量分析、氨基酸测定等。 英藉德裔生物化学家Krebs，在1937年发现了三羧酸循环，对细胞代谢及分子生物学的研究作出了重要贡献，他与美藉德裔生物化学家Lipmann共获1953年诺贝尔生理医学奖。,40年代： 两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化物质的关键技术。 电泳技术由瑞典的著名科学家Tisellius奠基，从而开创了电泳技术的新时代，他因此获得了1948年的诺贝尔化学奖。 层析技术和电泳技术用于分析生物大分子的组成和代谢的中间产物，示踪技术的应用推动了代谢的研究。 美国化学家Pauling确认氢键在蛋

3、白质空间结构中以及生物大分子间相互作用的重要性等，并因此而获得了诺贝尔化学奖。,50年代： 自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次将放射性同位素示踪用于碳水化合物及类脂物质的中间代谢的研究以后，射性同位素示踪技术50年代有了大的发展，为各种生物化学代谢过程的阐明起了决定性的作用。 1953年美国科学家Watson和英国科学家Crick提出DNA分子反向平行双螺旋模型，1962年与英国科学家Wilkins分享诺贝尔生理医学奖， Wilkins和Franklin通过对DNA分子的X-射线衍射研究为Watson和Crick的DNA模型提供了有力的实验证据， DNA双螺旋模型的

4、提出开创了生物科学的历史新纪元。 在X-射线衍射技术方面，英国物理学家Perutz对血红蛋白的结构进行X-射线结构分析, Kendrew测定了肌红蛋白的结构，成为研究生物大分子立体结构的先驱，他们同获1962年诺贝尔化学奖。 英国生物化学家Sanger还于1953年确定了牛胰岛素中氨基酸的顺序而获得1958年的诺贝尔化学奖。 Kornberg发现了DNA聚合酶，美藉西班牙裔科学家Uchoa发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。两人分享了1959年诺贝尔生理医学奖。,60年代： 各种仪器分析方法用于生物化学研究，取得了很大的发展，如HPL

5、C技术、红外、紫外、圆二色等光谱技术、NMR核磁共振技术等。 自1958年Stem，Moore和Spackman设计出氨基酸自动分析仪，大大加快了蛋白质的分析工作。1967年Edman和Begg制成了氨基酸序列分析仪，到1973年Moore和Stein设计出氨基酸序列自动分析仪，又大大加快了对多肽一级结构的测定，十多年间氨基酸的自动测定工作得到了很大的发展和完善。 在60年代，层析和电泳技术又有了重大的进展，在1968-1972年Anfinsen创建了亲和层析技术，开辟了层析技术的新领域。1969年Weber应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定了蛋白质的相对分子质量，使电泳技术取得了重大进展

6、。 美国生物化学家Nirenberg在破译遗传密码方面作出了重要贡献，Holly阐明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸排列顺序，后来证明所有tRNA的结构均相似。美藉印度裔生物化学家Khorana提出按预定的序列合成核酸分子的方法。他们3人共获1969年诺贝尔生理医学奖。 法国生物学家Lwoff、JAcob和生物化学家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共获1965年诺贝尔生理医学奖。,70年代： 基因工程技术取得了突破性的进展，Arber，Smith和Nathans三个小组发现并纯化了限制性内切酶，1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次用限制性内切酶切割了DNA分子

7、，并实现了DNA分子的重组。1973年，又由美国斯坦福大学的Cohen等人第一次完成了DNA重组体的转化技术，这一年被定为基因工程的诞生年，Cohen成为基因工程的创始人，从此，生物化学进入了一个新的大发展时期。与此同时，各种仪器分析手段进一步发展，制成了DNA序列测定仪、DNA合成仪等。,80年代 基因工程技术进入辉煌发展的时期，1980年，英国剑桥大学的生物化学家Sanger和美国哈佛大学的Gilbert分别设计出两种测定DNA核苷酸序列的方法，而与Berg共获诺贝尔化学奖，从此，DNA序列分析法成为生物化学与分子生物学最重要的研究手段之一。他们3人在DNA重组和RNA结构研究方面都作出了

8、杰出的贡献。 1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛细管电泳技术（HPCE），由于其高效、快速、经济，尤其适用于生物大分子的分析，因此受到生命科学、医学和化学等学科的科学工作者的极大重视，发展极为迅速，是生化实验技术和仪器分析领域的重大突破，意义深远。现今，由于HPCE技术的异军突起，HPLC技术的发展重点己转到制备和下游技术。,1984年德国科学家Kohler、美国科学家Milstein和丹麦科学家Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而共享了诺贝尔生理医学奖。 1985年美国加利福尼亚州Cetus公司的Mullis等发明了用PCR技术（Pol

9、ymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应扩增DNA的技术，对于生物化学和分子生物学的研究工作具有划时代的意义，因而与第一个设计基因定点突变的Smith共享1993年的诺贝尔化学奖 1988年，美国遗传学家McClintock由于在二十世纪五十年代提出并发现了可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖。 1989年，美国科学家Altman和Cech由于发现某些RNA具有酶的功能（称为核酶）而共享诺贝尔化学奖。,90年代： 1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在断裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理医学奖。 1994年，美国科学家Gilman和Rodbell由于发现了

10、G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖。 1995年，美国科学家Lewis、德国科学家Nusslein-Volhard和美国科学家Wieschaus由于在20世纪40-70年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发育基因而共享诺贝尔生理医学奖。 进入21世纪以来，PCR技术、生物芯片技术不断完善，基因组学、蛋白质组学、生物信息学发展迅速。,我国生物化学界的主要成就 我国生物化学界的先驱吴宪教授在20年代初由美回国后，在协和医科大学生化系与汪猷、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究。 1965年我国化学和生物化学家用化学方法在世界上首次人工合成了

11、具有生物活性的结晶牛胰岛素，1983年又通过大协作完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工合成。近年来，在酶学研究、蛋白质结构及生物膜的结构与功能等方面都有举世瞩目的研究成果。 90年代以来，我国参与了人类基因组计划，在水稻基因组研究中处于国际领先水平，在功能基因组学研究中取得不少成绩。,1.2 生化实验室的基本设施与装备,温度与环境设施 许多生化实验都要求在一定的温度和湿度下进行操作，因此，一个正规的生化实验室必须能够保持恒温、恒湿的环境。为了保持这些条件，实验室都应装备空调和加湿器等，而仪器分析室则要求保持干燥，一些怕潮湿和易水解的试剂应保存在干燥箱中。由于各种生物材料、制剂和各种生化试剂要求在

12、不同的温度下保存，实验室必须备有4、20、80的冰箱，需要在更低温度下保存的样品，则须使用液氮罐。对于需在较高温度下进行的操作，则可使用烘箱和高温电炉等。实验室还应备有干冰，以便使用乙醇-干冰浴进行样品的快速冷冻分装。,实验室用纯水 生化实验室使用最多的溶剂是“水”，配制生化实验用试剂不能用自来水，只能使用经过纯化的水。生化实验对所用水的纯度是要求比较高的，通常可以认为，水的质量越高，实验的结果就越真实可靠和准确，为此必须保证实验用水的质量。常用的两种纯水是二次蒸馏水和无离子水。在超纯分析和特殊的生化实验中要求更高的水质，如无菌水、亚沸蒸馏水、无二氧化碳蒸馏水等。根据实际工作的需要，来选用水的

13、种类，如：无离子水、普通蒸馏水、二次蒸馏水、亚沸蒸馏水及按特殊要求制备的高纯水等。 所有的各种纯水，在贮存中都会被污染：塑料容器会产生有紫外吸收的有机物；玻璃和金属容器会产生金属离子的污染；长时间放置更会使水长菌，空气中的二氧化碳会溶入水中，所以贮存高纯水一定要隔绝空气，密封盖严，必要时贮存在冰箱的冷藏室中。,消毒系统 生化实验要进行生物培养和生物反应的操作，这些操作都必须排除其他生物因素的干扰，因此在做这些实验之前，都必须对实验中用到的、可能造成污染的材料、器械等进行消毒灭菌处理。常用的灭菌方法有：高温、高压灭菌、紫外线照射、火焰焚烧、过滤除菌、酒精等试剂浸泡消毒等，因此实验室必须配备各种无

14、菌处理设备。 离心设备 离心方法是分离和制备生物大分子最常用的手段，因而生化实验室必须备有各种形式的离心机。常用的有普通台式离心机、高速冷冻离心机和超速离心机等。,计量系统 生化实验都要求在各种标准的定量条件下进行，因此实验室必须配备各种标准的定量系统。常用的定量系统有：称量系统、液体体积度量系统、pH测定系统、液体溶质定量系统等。 称量仪器：最常用的设备是各种千分之一的扭力天平、单、双盘天平和各种万分之一的电子天平等，它们分别用于各种缓冲液的配制和标准物质的称量等。 液体体积度量仪器：常用的有各种量筒、移液管、容量瓶、微量进样器和各种自动取液器等。 酸碱度pH测量仪器：最常用的是pH试纸和p

15、H计。 液体溶质定量仪器：此系统主要是根据液体溶质的某些理化特性而设计的，不同的物质在一定的条件下有特定的吸收光谱，其吸收值的大小与其在溶液中的浓度有一定的关系，可以通过测定某物质在溶液中的吸收光谱来计算出该物质的浓度，因而分光光度计就是生化实验室必备的仪器分析手段。主要有可见分光光度计和高档的快速扫描紫外可见分光光度计等。,电泳装置 电泳是生化实验中最常用最重要的实验技术之一，主要用于分析、鉴定，也可用于制备。电泳装置由电源和电泳槽两部分组成，详见第4章。 层析系统 层析又称为色谱，是分离各种生物大分子的主要手段之一，因而各种层析系统和核酸蛋白检测器就是生化实验室最常用的仪器设备。主要的层析

16、技术有：吸附层析、凝胶排阻层析、离子交换层析和亲和层析等，详见第3章。 PCR仪 PCR(Polymerase Chain Reaction)是指聚合酶链式反应。该反应是用DNA聚合酶在体外大量扩增DNA片段的一种方法。PCR仪就是将此方法实现了自动化操作的一种仪器，是生化与分子生物学实验常用和必备的设备。,其它设备 实验室除以上常规设备和设施外，还必须装备下列一些常用设备： A.通风柜：用于有害和有毒气体的操作。 B.微波炉：用于化冻、灭菌及其他一些需要快速加热的操作。 C.组织打碎机和匀浆器：用于各种生物材料、动植物组织和细胞的破碎。 D.超声清洗机：用于各种器皿、移液管和自动取液器吸头的

17、清洗和高效液相色谱仪所用流动相的脱气等。 E.冰冻干燥机：用于生物大分子水溶液的冰冻干燥，可由其水溶液直接制得固体干粉。 F.机械和水环式真空泵：用于旋转蒸发器和各种真空抽气操作。 G.旋转蒸发器：用于各种水溶液和有机溶液的旋转减压蒸馏操作。 H.酶标仪：用于免疫化学实验的酶联免疫吸附测定。,绝对误差（absolute error）： 绝对误差是测量值与真实值之差。 = x (：绝对误差；x：测量值；：真实值） 绝对误差是以测量值的单位为单位，可以是正值，也可以是负值。测量值越接近真实值，绝对误差越小。 真实值是一个可以接近而不可达到的理论值。上式可以写成： = x- 说明在已知绝对误差值的情

18、况下，真实值可以从测定值减去绝对误差而求得。,相对误差（relative error）： 为了反映误差在测量结果中所占的比例，分析工作中经常使用相对误差。相对误差是以真实值的大小为基础表示的误差值，没有单位。 /=(x-)/ 通常以%， 或 ppm表示。 例如：测定纯NaCl中Cl的百分含量为60.52%，而其真实含量（理论值）为60.66%。则 绝对误差=60.52%60.66% = -0.14% 相对误差=（60.52% 60.66%） / 60.66% 1000 = -2.3 ,如果不知道真实值，而知道绝对误差值，则相对误差也可以表示为： 相对误差 = 100% x 例如：用分析天平称两

19、个重量，一个是0.0021g，另一个是0.5432g，两个重量的绝对误差都是0.0001g，可是相对误差却大不相同，一个是（1/21 ）100%，另一个是（1/5432 ）100%。 可见，由于两个被测组分含量高低不同，即使绝对误差相同，相对误差也不同。对高含量组分测定的相对误差应当要求小些，低含量组分测定的相对误差要求允许大些。 例如：用重量法和滴定法测量样品主要成分，相对误差需要达到千分之一，而用比色法测定样品重微量成分时，相对误差只要求达到百分之几即可。,2. 系统误差 系统误差（systematic error）也叫“可定误差”，是由某种确定的原因引起的，一般有固定的方向（正或负）和大

20、小，重复测定时重复出现。根据系统误差的来源，可分为： （1） 方法误差 方法误差是由于不适当的实验设计或所选方法不恰当所引起的，通常影响较大。比如：滴定分析中终点与化学计量点不相符合、重量分析中沉淀的溶解度过大或有共沉淀等，都会产生误差。 （2） 仪器或试剂误差 是由于仪器未经校准或试剂不合规格引起的。例 如：天平砝码不准、容量仪器刻度不准或试剂不纯等，均能产生这种误差。,（3） 操作误差 操作误差是由于分析者操作不符合要求引起的。 例如：分析者对滴定终点颜色改变的判断能力不够高，总是偏深或偏浅，便会产生误差。 由于系统误差是重复的以固定方向和大小出现，所以能用加校正值的方法加以消除，但不能用

21、增加平行测定次数的方法消除。,3.随机误差（accidental error ): 也称偶然误差，是由于偶然的原因，如测量条件、实验室温度、湿度等变动而未能得到控制的条件波动引起的，其大小和正负都不固定。 偶然误差的出现看起来似乎没有规律，但多次测量就会发现绝对值相同的正负偶然误差出现的概率大致相等，它们之间能完全或部分抵消。因此通过增加平行测定次数，就可以减免测定结果中这种误差。也可以通过统计学方法估计出偶然误差值，并在测定结果中予以正确表达。 系统误差和偶然误差往往不能区分。比如：在观察滴定终点的颜色变化时，有人总是偏深，产生系统误差。但多次测定中偏深程度不一样，又必然有偶然误差。,4.准

22、确度和精密度 （1）准确度（accuracy）： 表示分析结果与真实值接近的程度。准确度的大小，用误差表示。误差越大，准确度越低。 （2）精密度（precision）： 表示平行测量的各测量值之间的相互接近程度,表示测量的重现性。用以下几个指标表示: A.偏差d = Xi - X平均 B.平均偏差：各个偏差绝对值的平均值,即 平均偏差=偏差/n C.相对平均偏差 S=（平均偏差/ X平均） 100%。 D.标准偏差:各个偏差的平方值和除以样本个数n1，再开平方。即 （S)= 偏差2/（n1）1/2 E.相对标准偏差 RSD =（标准偏差/ X平均） 100%。,5.提高分析准确度的方法,（1）

23、选择恰当的分析方法 不同方法的准确度和灵敏度不同。重量分析法和容量分析法灵敏度虽然不高，但对常量组分的测定可以获得比较准确的结果，一般相对误差不超过千分之几。但对于微量和痕量组分的分析，常常做不出来，谈不上精确度。 仪器分析法对测定常量组分无法准确，但对测定微量和痕量组分灵敏度很高，尽管相对误差较大，但绝对误差不大，能符合准确度的要求。 总之，必须根据分析对象，样品情况以及对分析结果的要求，选择恰当的分析方法。,（2）减小测量误差 为了保证分析结果的准确度，必须尽量减小各步的测量误差。 例如：一般分析天平的称量误差为+0.0001g，用减重法称量两次，可能引起的最大误差是+0.0002g，为了

24、使称量的相对误差小于0.1%，取样量就不能小于0.2g。,（3）消除测量中的系统误差 A、校准仪器：对砝码、滴定管和移液管进行校准。 B、做对照实验：用含量已知的标准试样或纯物质当样品进行分析，由分析结果和其已知含量的差值，确定分析的误差。 C、做空白实验：在不加样品的情况下，以与样品相同的方法、步骤进行分析，把所得的结果作为空白值从样品分析结果中减去。这样可以消除由于试剂不纯或容器不符合要求所带进的误差。,8.有效数字 有效数字是指分析工作中实际测到的数字，允许最后一个数字是可疑数，反映测量值的准确度，要与测量的方法相适应。 一般分析数据保留4位有效数字，保留的位数太多无实际意义，反而增加计

25、算的麻烦。要注意0.0052的有效数字只有2位，3个0是用于定位的无效数字。 修约有效数字的原则是四舍六入五成双。如23.4550.546修约为23.460.55， 28.4450.675修约为28.440.68，要避免出现0.000020.00001之类的数字，或3658.25430.0058之类的数字。,五、生物化学常用缓冲液 （一）基本概念 Bronsted-Lowry酸碱理论（酸碱质子理论）: 1923年由丹麦化学家J.N.Brnsted和英国化学家T.M.Lowry同时提出了酸碱质子学说，认为凡能释放质子的分子或离子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4- 等）称为酸，凡能接受质子

26、的分子或离子（如：H2O，NH3，Cl-等）称为碱。因此，一种酸释放质子后即成为碱，称为该酸的共轭碱，同样一种碱与质子结合后，形成对应的酸，称为该碱的共轭酸。 如盐酸在水中的解离： HCl Cl- H+ HCl是酸，Cl-是它的共轭碱。 pH = pKa+log质子受体/质子供体, 缓冲体系的设计： 1960年，N.E.Good和他的同事们提出，适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性： pKa值在6-8之间； 在水中的溶解度高； 不易穿透生物膜； 盐效应小； 离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小； 不与金属离子生成复合物或沉淀； 该缓冲剂化学稳定； 紫外和可见光波长范围内光吸收小； 易

27、制得高纯度的盐。,（二）生物化学常用缓冲液 磷酸盐缓冲液： 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽： NaH2PO4： pKa12.12， pKa27.21 Na2HPO4： pKa17.21， pKa212.32 配酸性缓冲液： 用NaH2PO4，pH1-4， 配中性缓冲液： 用混合的两种磷酸盐，pH6-8， 配碱性缓冲液： 用Na2HPO4，pH10-12。 用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾

28、盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。,磷酸盐缓冲液的优点为： 容易配制成各种浓度的缓冲液； 适用的pH范围宽； pH受温度的影响小； 缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。 其缺点为： 易与常见的钙Ca+离子、镁Mg+离子以及重金属离子缔合生成沉淀； 会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。, Tris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液： Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。 Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如： Tris-HCl缓

29、冲液： pH7.5-8.5 Tris-磷酸盐缓冲液： pH5.0-9.0,Tris-HCl缓冲液的优点是： 因为Tris的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液； 对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。 其缺点是： 缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH值的变化大于0.1； 温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，例如：4时缓冲液的pH8.4，而37时的pH7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于0-4。 易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封。 此缓冲液

30、对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。, 有机酸缓冲液： 这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，pH范围为酸性，即pH3.0-6.0，最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等。 有机酸缓冲液的缺点是： 所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反应过程可能发生干扰作用； 柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子（Fe3+、Zn+、Mg+等）结合而使缓冲液受到干扰； 这类缓冲液易与Ca+离子结合，所以样品中有Ca+离子时，不能用这类缓冲液。, 硼酸盐缓冲液： 常用的有效pH范围是：pH8.5-10.0，因而它是碱性范围内最常用的缓冲液，其优点是配制方便，只使

31、用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物，尤其是能与糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。, 氨基酸缓冲液： 此缓冲液使用的范围宽，可用于pH=2.0-11.0，例如最常用的有： 甘氨酸-HCl缓冲液：pH=2.0-5.0， 甘氨酸-NaOH缓冲液：pH=8.0-11.0， 甘氨酸-Tris缓冲液：pH=8.0-11.0，（广泛使用的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液）， 组氨酸缓冲液：pH=5.5-6.5， 此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。 其缺点是： 与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生物化学反应过程，如代谢过程等。 试剂的价格

32、较高。,六、 pH值的测定,测定溶液pH值通常有两种方法，最简便但较粗略的方法是用pH试纸，分为广泛和精密pH试纸两种。 广泛pH试纸的变色范围是pH=1-14、9-14等，只能粗略确定溶液的pH值。 精密pH试纸，可以较精确地测定溶液的pH值，其变色范围是2-3个pH单位，例如有pH=1.4-3.0、5.4-7.0、9.5-13.0等许多种，可根据待测溶液的酸、碱性选用某一范围的试纸。 测定的方法是将试纸条剪成小块，用镊子夹一小块试纸，用玻璃棒蘸少许溶液与试纸接触，试纸变色后与色阶板对照，估读出所测pH值。切不可将试纸直接放入溶液中，以免污染样品溶液。,第二节 紫外可见分光光度法,一、基本原

33、理,（一）Beer-Lambert 定律 当一束单色光通过溶液时，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就会减弱。设入射光的强度为I0，透过浓度为c，液层厚度为b的溶液后，透射光的强度I必定小于I0，随浓度和厚度的增加，光被吸收的程度亦增加，透射光的强度则减小。透射光强度与入射光强度的比值，称为透光度(transmittance)，以T表示。实验证明，当液层厚度b和溶液浓度c按算术级数增加时，透光度T按几何级数减小，数学式为： A-lgTabc A：吸光度，又称光密度“O.D”；T：透光度， TI / I。； a：吸光系数（Lmol1cm1）； b：样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收池，

34、则b=1cm； c：样品浓度（mol/L）。 当a、c一定时，吸光度A与液层厚度b成正比，称为朗伯定律(Lamberts law)。 当a、b一定时，吸光度A与溶液浓度c成正比，称为比尔定律(Beers law)。 吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，称为朗伯比尔定律，简称比尔定律，即光的吸收定律。其数学表达式为：A=abc,式中的a为比例常数，称吸光系数，有两种表示方式： 1.摩尔吸光系数,是指在一定波长时，溶液浓度为1mol/L，厚度为1cm的吸光度，用或EM表示。 2.百分吸光系数或称比吸光系数,是指在一定波长时，溶液浓度为1%(W/V)，厚度为1cm的 吸光度，用E1%1cm表示。

35、 吸光系数两种表示方式之间的关系是： = Mr/10 E1%1cm 摩尔吸光系数是物质对某波长的光的吸收能力的量度。越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。值越大，说明电子跃迁的几率大，通常 10-105：一般认为 104为强吸收；103-104 为较强吸收； 102 为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。 因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A0.001, 所以，当b1cm, 105时，可检测的溶液最小浓度是C10-8 mol/L。 的值很难直接测定，通常要先测出E1%1cm再按公式计算求得。,吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性： 即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份

36、各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。 若溶液中各溶质的吸光系数相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。 例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，已知其摩尔吸光系数 = 8.2103 M-1cm，计算其摩尔浓度。 L）。 AbC A（溶剂加样品的吸光度）（溶剂的吸光度） A0.6500.0700.580 b1cm C=7.110-5 mol / L,3. 影响吸光系数的因素,吸光系数的大小，取决于物质(溶质、溶剂)的本性和光的波长。 1.物质不同，则吸光系数不同。以吸光系数可作为

37、物质的特性常数。在分光光度法中，常用摩尔吸光系数来衡量显色反应的灵敏度，值越大，灵敏度越高。 2.溶剂不同，其吸光系数亦不同。所以在说明某一物质的吸光系数时，应注明溶剂。 3.光的波长不同，其吸光系数亦不同。如将不同波长的单色光依次通过被分析物质，分别测得吸光度，然后绘制吸光度波长曲线，称为吸收曲线(absorption curve)，又称吸收光谱(absorption spectrum)。由吸收曲线可以看出物质的吸收特征。吸收曲线上有极大值 的部分，称为吸收峰。吸收峰所对应的波长，称为最大吸收波长，以符号max表示 ，这是物质定性的依据之一。物质的定量也常选择在max处测定其吸光度，因为在此

38、处测定的灵敏度最高。 4.单色光的纯度也影响吸光系数。单色光越纯，即经单色器分光后的波长范围越窄，其吸光系数越大。严格说来，朗伯比尔定律只有当入射光是单色光时才完全适用，但实际上不管仪器中光学系统的质量怎样高，单色化以后的光还是具有一定的宽度，这取决于仪器的精确程度。滤光片的分光本领较差，故一般测得的吸光系数要比真值小得多。,吸收池使用注意事项： 要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在 1洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净，要求杯壁不挂水珠，还可以用绸布丝线或软塑料制作一个小刷子清洗杯子。 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。严禁用硬纸

39、和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。,4. 检测器: 检测器是一种光电转换设备，即把光强度以电讯号显示出来，常用的检测器有光电管，光电倍增管和光电二极管等三种。 光电管：光电管可检测10微微安（10-11A）的光电流，管内抽真空充入惰性气体. 光电倍增管：它是检测弱光的最灵敏最常用的光电元件，其灵敏度比光电管高200多倍，光电子由阴极到阳极重复发射9次以上，每一个光电子最后可产生106-107个电子，因此总放大倍数可达106-107倍，光电倍增管的响应时间极短，能检测10-8-10-9秒级的脉冲光。其灵敏度与

40、光电管一样受到暗电流的限制，暗电流主要来自阴极发射的热电子和电极间的漏电。 光电二极管：其原理是这种硅二极管受紫外-近红外辐射照射时，其导电性增强的大小与光强或正比。近年来分光光度计使用光电二极管作检测器在增加，虽然其灵敏度还赶不上光电倍增管，但它的稳定性更好，使用寿命更长，价格便宜，因而许多著名品牌的高档分光光度计都在使用它作检测器。,5. 显示装置: 低档分光光度计现在已都使用数字显示，有的还连有打印机。现代高性能分光光度计均可以连接微机，而且有的主机还使用带液晶或CRT荧屏显示的微处理机和打印绘图机，有的还带有标准软驱，存取数据更加方便。,三、分光光度法的定性与定量方法 （一）定性方法：

41、 一系列不同波长的单色光照射待测溶液，可测的一系列相应的吸光度。以吸光度为纵坐标，以波长为横坐标作图，可以得到待测物质的吸收曲线。通过与标准品比较而定性。 实际工作中常用max 和来定性，max 可以从吸收曲线中吸收峰所对应的波长直接找出； 通常需配置待测物质三种不同浓度的溶液，在1cm的吸收池中，在max处分别测定其吸光度，根据A= bc,即=A/bc，计算出，将三次结果平均，即是该物质的摩尔吸光系数。,从吸受光谱中初步推断官能团： 一个化合物在220-800nm范围内无吸收（1），它可能是脂肪族饱和碳氢化合物、醇、醚、羧酸、胺等，不含直链或环状共轭体，没有醛、酮等基团。在210-250nm

42、有吸收带，可能含量2个共轭单位250-300nm有弱吸收带，表示有羰基存在。 异构体的推定： 许多异构体可以利用双键位置不同，通过紫外吸收光谱推断异构体结构。 化合物骨架的推定： 未知化合物与已知化合物的紫外吸收光谱一致时，可以认定两者具有同样的发色团。通过这个原理可以推定未知化合物的骨架。,（二）定量方法： 根据比尔定律，物质在一定波长处的吸光度与浓度之间有线性关系。因此，只要选择一定的波长测定溶液的吸光度，即可求出浓度。 1.吸光系数法（绝对法）： 根据比尔定律A= c l ，若 l 和吸光系数或E1%1cm已知，即可根据测得的A，求出被测物的浓度。 C = A / l 通常或E1%1cm

43、可以在手册或文献中查到。 示例见课本P10.,2.标准曲线法: 在有些情况下，如单色光不纯等情况，测得的吸光值随所用仪器不同而有相当大的变化。若此时用吸光系数换算成浓度，将产生很大的误差。 但如果只用一台固定的仪器，则可认定在固定的工作状态和测定条件下，浓度与吸光度之间的关系在许多情况下是线性关系或接近于线性关系。 A=KC(K只为比例常数，而非物质常数） 依据上式的关系进行定量是分光光度法中比较简便易行的方法。,标准曲线的制作 （1）配置一系列浓度不同的标准溶液。 （2）在测定条件相同的情况下，分别测定其吸光度。 （3）以标准溶液浓度为横坐标（不必考虑显色剂等引起的浓度变化），以相应的吸光度

44、为纵坐标，绘制A-C关系图。 （4）在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。,A,C,0,Ax,Cx,如Folin酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质含量 取14只试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL标准蛋白质溶液(250 g/mL)，用水补足到1mL，加入5mL试剂甲，混匀，于20-25放置10分钟。再加入0.5mL试 剂乙(Folin氏试剂)，立即振摇均匀，在20-25保温30分钟，然后于500nm处比色。取两组测定的平均值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量的依据 。横坐标的蛋白质浓度分别为0，25，50，1

45、00，150，200，250，单位为g/mL，不可将上述数字再除以6.5，将数字变成一个小数。,3.对照法: 在同样条件下配置标准溶液和样品溶液，在选定波长处，分别测量吸光度，根据定律 A标=E C标l A样=E C样l 在同种物质、同台仪器及同一波长测定的条件下l 和E 均为定值，所以： A标/A样 = C标/C样 C样 = C标（A样/ A标）,四、减小测定误差的方法,1.选择合适的显色剂，使显色反应的灵敏度高、选择性好、显色产物稳定。 2.通过条件试验，找出最佳的试剂加入量、酸度、温度和显色时间。并使样品与标准品在尽可能完全相同的条件下进行测定。 3.通过加掩蔽剂和控制pH值，消除共存离

46、子的干扰。 4.尽可能在吸光度0.1-1.0范围内测定，以减小吸光度误差。A1.0的溶液，可通过稀释或用薄的吸收池来降低吸光度。 5.减小仪器误差。用稳压器稳定电源以使入射光强度保持不变；吸收池厚度应一致，透光性好，不要用手摸透光面；吸收池与入射光线应垂直，否则会因光程增大而发生误差。,四.离心操作的注意事项,高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程。 超速冷冻离心机:未经过培训和考核者不能使用。 其它普通离心机：按照操作要求进行。,1.使用各种离心机时，必须事

47、先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。 2.离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。 3.若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。,4.装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将

48、液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。,5.离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。 6.每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。 7.离心时不准开盖，不准用手停止转头。,移液器的使用,1 设定

49、移液体积 l 从大体积调节到小体积时，为正常调节方法，逆时针旋转刻度即可； l 从小体积调节至大体积时，可先顺时针调至超过设定体积的刻度，再回调至设定体积，这样可以保证最佳的精确度。 2 装配移液器吸头 l 单道移液器，将移液端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可 用移液器反复撞击吸头来上紧的方法是不可取的，这样操作会导致移液器部件 因强烈撞击而松散，严重的情况会导致调节刻度的旋钮卡住。 l 多道移液器，将移液器的第一道对准第一个吸头，倾斜插入，前后稍许摇动上紧，吸头插入后略超过O型环即可。,养护： 1、如液体不小心进入活塞室应及时清除污染物； 2、移液器使用完毕后，把移液器量程调至最大值，且将移液器垂直放置在移液器架上； 3、根据使用频率