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1、B 淋 巴 细 胞 杂 交,实验四,杂交的目的- 制备单克隆抗体,杂交瘤技术的基本原理 具有分泌功能的B细胞难以在体外长期存活。利用细 胞融合技术，将免疫后的B细胞与在体外能长期存活的 骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养获取杂交细胞， 这种细胞称为杂交瘤细胞（Hybridoma）。 ：该细胞的特点： 1、具有免疫B淋巴细胞分泌特异性mAb的功能； 2、具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力。故应用杂交瘤 细胞生产单克隆抗体。,杂交瘤技术基本过程示意图,HAT选择性培养 HAT分别代表次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基碟呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶（thymidine, T）三 种物
2、质。 细胞的DNA生物合成有两条途径：,Choice of animal The mouse is usually the animal of choice. Suitable mouse myeloma cell lines are widely available, and grown of hybridomas in mice is usually no problem. All of the currently available mouse myeloma lines, which are suitable for fusion, are of BALB/C origin, 6-8
3、week, female mouse is usually used .,Choice of myeloma cell 1. NS-1, has been very widely used for hybridoma production. When cultured alone, it synthesizes light chains. 2. X63 and Sp2/0 are the current lines for fusion . Sp2/0 hybridoma appear to be somewhat more Sensitive than NS-1 to environment
4、al conditions.,Fusing agent All current hybridoma work uses polyethylene glycol (PEG) as the fusing agent. The exact molecular weight PEG seems to be unimportant. Most investigators have used PEG of molecular weight 500-6000. Note that the number assigned to PEG does not necessarily indicate its mol
5、ecular weight. concentration of PEG range from 30% to 50%. Below 30%, the fusion frequency is low, and above 50%, toxicity becomes overwhelming.,动物免疫 一、可溶性抗原 1wk 抗原50g /只，溶于300l 生理盐水中， 加入等量福氏完全佐剂（CFA）充分乳化， 分颈、部皮下多点及腹腔注射； 3wk 抗原的剂量及注射的部位同上，仅将全佐 改为半佐（IFA）； 5wk 抗原50g /只，溶于300l 生理盐水中， 腹腔注射； 加强 融合前35天 抗原
6、2030g /只，溶于 50l 生理盐水中，小鼠尾静脉注射以加 强免疫。,二、细胞抗原 1wk 细胞数量8106个/只，洗涤三遍，用0.30.4ml的生理 盐水重新悬浮，腹腔注射； 3wk 细胞数量6106个 /只，细胞的预处理及注射的部位同上； 5wk 细胞数量5106个 /只，细胞的预处理及注射的部位同上； 加强 融合前的45天 细胞数量3106 个/只，加强免疫。 在以肿瘤细胞作免疫原时，为避免免疫过程中小鼠因生长肿 瘤而死亡。故用丝裂霉素处理免疫原细胞，抑制其生长繁殖 以防形成肿瘤。最后的加强免疫，肿瘤细胞可不经丝裂霉素 处理，因45天后即进行融合。,免疫脾细胞的制备 处死小鼠，固定于
7、解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置 于120目的钢丝网中，将网移入盛有20ml生理盐水 的平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞 悬液，吸取1ml细胞悬液（约5106细胞）, 与骨髓 瘤细胞SP2/0（ 5105细胞）混合，离心后弃上清。 1、骨髓瘤细胞:免疫脾细胞为1:10 2、一个脾脏可获约108个细胞,1、取 PEG溶液1.0ml 缓慢加入混合细胞中, 边加边搅拌； 2、静止1分钟； 3、加HAT培养基4ml；,细胞的融合：,4、取融合细胞悬液1ml,滴加在96孔培养板中，每孔1滴（约50l）； 5、显微镜下观察融合细胞的状态。,实验目的： 1、了解细胞杂交及单抗制备的基本原理； 2、掌握细胞融合的基本操作。, 实验结束后，将实验小鼠放入垃圾袋，使用过的 剪刀、镊子、试管及培养板等冲洗干净，放回原 处，谢谢合作！,