实验4-琼脂糖凝胶电泳检测DNA-2010.ppt

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1、实验四 琼脂糖凝胶电泳检测DNA,一、实验目的,通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术,检测上次实验课提取的质粒DNA,二、实验原理,带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法 泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下,单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比,与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率,在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率 影响泳动率的因素包括样品的物理性状、支持物介质、电场强度和缓冲液离子强度 DNA的凝胶电泳常使用两

2、种支持介质:琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶,关于电泳,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应 在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动 在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型 琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子 可以分离长度为100b

3、p至近60kb的DNA分子,常采用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系,质粒DNA分子有三种构型: CC DNA(共价闭合环状DNA:两条核苷酸链均保持着完整的环形结构,DNA呈现超螺旋 )、 OC DNA(开环DNA: 质粒的一条链断裂) L DNA (线形DNA: 质粒的两条链均断裂), 这三种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的泳动率不同,因此电泳后呈三条带,CC DNA泳动最快,其次是LDNA,最慢的是OCDNA,电泳方向,EB:即溴化乙锭,它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入,在紫外光的照射下,凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光,易于检测。可以检测10n

4、g 的DNA 注意:EB是一种诱变剂,操作时一定要注意安全,必须戴塑料或乳胶手套,GoldView :是一种可代替EB的新型核酸染料,采用琼脂糖电泳检测DNA时,GoldView与核酸结合后能产生很强的绿色荧光信号,其灵敏度与EB相当,使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光,而且也可用于染RNA。,DNA的染料,线性DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶,由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED的作用下聚合而成 可以分离小片段(5500bp)DNA分子 聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用:

5、 蛋白质分子的分离鉴定 蛋白质分子量的测定 核酸的分析 核酸序列测定,在pH值为8.0-8.3时,核酸分子碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电泳时向正极移动。采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛作用下,使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。,实验原理,三、仪器、材料与试剂,微波炉 琼脂糖凝胶电泳系统 紫外线透射仪 质粒DNA DNA marker 50TAE 6凝胶加样缓冲液 琼脂糖 1溴化乙锭溶液,四、实验步骤,1. 装好制胶装置用胶带将

6、洗净、干燥的制胶板两端封好(一定封严,不能留缝隙),使用水平仪,将胶板调至水平,插入适当梳子 2. 将1g 琼脂糖加入100ml 1TAE电泳缓冲液中,摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解(冷却到60,加入5l的1 EB,并摇匀),则为1琼脂糖凝胶液 3. 将溶解的琼脂糖(约50)倒入,室温冷却凝固 4. 充分凝固后小心垂直向上拔出梳子,撕掉两端的胶布,将凝胶置入电泳槽中(注意:DNA样品孔应朝向负电极一端),加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶0.5cm,5. 用移液器吸取质粒样品5l于封口膜上,再加入1l 的6加样缓冲液,混匀后,小心加入点样孔 (记录电样的顺序和电样量) 6. 打开电源开关

7、,调节电压至35V/cm,可见溴酚蓝条带由负极向正极移动 (注意DNA片段从负极向正极移动) 7. 当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿12cm处,停止电泳 8. 将凝胶置于紫外线透射仪上,打开紫外灯,DNA存在处显出桔红色荧光条带(注意:紫外线对眼睛有伤害作用,应戴上防护眼睛),每班4组,约30人 每组7人:1套琼脂糖凝胶电泳系统(电泳槽、电泳仪、制胶板、有机玻璃槽、8孔梳子),20L或10L移液枪1支,冰盒1个,50mL锥形瓶1个(贴上EB标签)。 每班配2台电炉,线手套2副。,实验分组,五、思考题,EB的中文名称是什么?使用EB时应注意些什么? 怎么制备一块20mL体积1琼脂糖凝胶(含溴化乙锭溶液终浓度0.5g/mL)? 什么是Loading Buffer?Loading Buffer中含有哪些成分?各组分的作用是什么?,1 倒胶时把握好胶的温度,不要高于60 ,否则温度太高会使制板变形 2 胶一定要凝固好才能拔梳子,方向一定要竖直向上,不要弄坏点样孔 3 点样时枪头下伸,点样孔内不能有气泡,缓冲液不要太多 4 EB有毒,切勿用手接触,更不要污染环境,胶勿乱扔 5 紫外线照射不要太久,注 意,凝胶电泳槽,

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