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1、微生物学实验,余雪冰,实验一,显微镜的使用和细菌的简单染色,显微镜介绍,油镜的使用原理,染色原理,实验目的,实验原理,实验材料,实验程序,作业,显微镜的使用,细菌简单染色的流程,实验目的,了解光学显微镜的构造并掌握其使用方法，重点掌握油镜的使用方法 掌握简单染色的原理及方法 学习并掌握无菌操作技术,返回,实验原理显微镜介绍,普通光学显微镜(NIKON) 欧林巴斯（OLYMPUS）生物显微镜 麦克奥林生物显微镜,显微镜的放大倍数和分辨率,1.放大倍数=接物镜放大倍数接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为： D=/2nsin(/2 )
2、式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。,实验原理油镜使用的原理,油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。,油浸没物镜 介质：左空气；右香柏油,实验原理染色剂和染色原理,回目录页,由于微生物细胞含有大量水分（一般在80-90%以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。所以，
3、除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。但是，任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。 微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。 化学因素如：正负离子之间的相互吸引等。,实验原理染色剂和染色原理,染色剂 染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型： 1. 酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。 2. 碱性染料：一般有碱性复
4、红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。 3. 中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。 4. 单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b)的染料。,细菌的等电点较低，pH值大约在25之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。,实验原理染色剂和染色原理,微生物染色常用染料如下表：,实验原理细菌的三种基本形态,球菌（S
5、pherical coccus）:包括双球菌、链球菌、葡萄球菌、四链球菌、八叠球菌等,杆菌(Rod-shaped bacillus)：短小、粗大、细长、棒状、分支,螺旋菌(Spired-shaped spirallum)：弧菌、螺菌,球菌,肺炎链球菌,淋球菌,化脓性链球菌,金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus (division),杆菌,破伤风杆菌,肉毒芽孢杆菌,炭疽杆菌,大肠杆菌,杆菌,变形杆菌,大肠杆菌,绿脓杆菌,螺菌,钩端螺旋体,幽门螺杆菌,霍乱弧菌,Spirulina sp. - Filamentous Cyanobacterium,实验材料,器材：显微镜、擦镜纸
6、、吸水纸、载波片、盖玻片、接种环、酒精灯、废液缸、洗瓶等。 细菌形态的染色标本。 菌种： 大肠杆菌（E.coli）、 金黄色葡萄球菌 染色液和试剂：吕氏美蓝、香柏油、二甲苯(或者乙醇乙醚溶液）等-,实验程序显微镜的使用,1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 2.调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯（或者乙
7、醇乙醚溶液）擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。,主要是油镜的使用,显微镜保养和使用中的注意事项：,1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度，用完油镜必须进行“三擦”。 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。 5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免
8、镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。,实验程序细菌简单染色,蒸馏水,涂片,接种环,自然干燥,固定,吕式美兰,染色1min,水洗,干燥,擦拭,水洗时不要直接冲菌膜,每位学生一人一组，取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，各做一块涂片。,染色注意事项,1.涂片过程中，去生理盐水和细菌不宜过多，涂菌要均匀，不宜过厚。,2.固定时温度不可过高，以载玻片背面不烫手背为宜，因为温度过高会破坏细胞的形态。,3.水洗时，不应直接冲洗细菌涂面，水流不应过大、过急，以免细菌涂面被冲掉。,错误操作示范,实验报告,根据观察结果，画出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图，并注明菌体染色后的颜色。 绘图的几点要求： 绘图要如实反映观察到的情况； 图必须要用铅毛绘制； 如有要求注明各个构造的名称，须用引线平等引至图的左右侧再行标注； 要标出图的名称并注明观察时所用的放大倍数,思考题,油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 使用油镜时，为什么必须用镜头油？观察微生物不用油镜头的话，微生物和普通镜头的镜片之间相隔了空气，会因盖玻片折射的光线导致无法得到清晰图像，这都是由于微生物体积太小的缘故。所以要用油镜头，就是在镜头和盖玻片之间滴上几滴油状有机物，排掉空气，容易观察到清晰图像。俗称油镜 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？,下周实验,实验二 细菌的革兰氏染色 （书中实验十四）,