《L-天冬酰胺酶的生产工艺PPT.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《L-天冬酰胺酶的生产工艺PPT.ppt（12页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、生工本2009级4班,刘培培 20092513418,L-天冬酰胺酶的生产工艺,LOGO,（一）天冬酰胺酶的化学组成和性质,天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，用于治疗白血病。1922年Clementi发现豚鼠血清中存在天冬酰胺酶；1953年Kidd发现豚鼠血清中有抑癌作用的物质，其活性成分是蛋白质；1961年Broome确定了其有效成分是天冬酰胺酶，后来，Mashburn等报告指出从大肠杆菌中分离出天冬酰胺酶，具有同样抗癌活性。 天冬酰胺酶呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮 三氯甲烷 乙醚和甲醇，水溶液20储存7d，5储存14d均不减少酶的活力。干品50 1
2、5min酶活力降低30，60 1h内失活，最适PH8.5，最适温度37。,（二）国内天冬酰胺酶的发展历程,目前,国内临床上应用的L2ASP 主要来源于大肠杆菌,我国天津生化厂于1974 年开始生产E1coli天冬酰胺酶,但由于菌种产酶能力低,提取精制工艺落后,难以与国外产品竞争,再加之其他原因最后停产。为了填补国内空白,1995 年,中国药科大学吴梧桐教授等率先进行了E1coli 天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表达研究,并首次在国内成功构建了高效表达L2ASP 的基因工程菌pKA/ CPU210009 ,工程菌发酵单位比野生株高出100 倍。随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺,确定了重
3、组L2ASP 的纯化路线,并对重组产品进行了鉴定。结果表明,基因工程菌生产的产品质量与天然品从基因序列、蛋白质一级结构到蛋白质的物理化学性质等方面均一致,两者具有同质性 。这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用E1coliL2ASP 开辟了新的道路。,（三）抗肿瘤机制,L2ASP 抗肿瘤的作用机制在于它能够降低人 体内L2天冬酰胺和L2谷氨酰胺的浓度,这两种氨基胞缺乏天冬酰胺合成酶,不能合成L2天冬酰胺,需酸是合成嘌呤环和嘧啶环的重要组成部分。肿瘤细要摄取外源L2天冬酰胺才能存活。当外源L2天冬酰胺被分解掉时,癌细胞合成核苷酸和蛋白质的能力就会显著降低,因此L2ASP 能有效抑制肿瘤细
4、胞的增殖。有研究表明, L2ASP 能够选择性抑制体内Ra2pamycin2靶标信号传导通路,从而抑制肿瘤的增值 。另有文献报道,L2ASP 在体内发挥作用时可能是通过一种功能性的p53 蛋白因子来介导肿瘤细胞的凋亡 。,（四）工艺流程,大肠杆菌产生的L2ASP 包括L2ASP 和L2ASP ,其中L2ASP 存在于细胞质中,与底物L2天冬酰胺的亲和力很小(Km = 1 10 - 3 mol/ L) ,没有抗肿瘤活性;而L2ASP 则分泌在细胞周质中,与L2天冬酰胺有很高的亲和力( Km = 1 10 - 5 mol/ L) ,有抗癌活性3 。现今,产生L2ASP 的菌种主要包括Escheri
5、chia coli 、Erwinia carotovara、Serralia marcescem、PseudomonasSp1、Wolinella succinogenes 等。 主要采用的提纯方法包括硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、离子交换层析法、超滤、水系二相胶束系统、分批式吸附和直行式解吸附法、渗透休克法以及亲和层析法等816 。采用不同方法最终得到目标产物的酶活力范围为220520157 U/ mg ,总回收率为31 %86 %。,天冬酰胺酶工艺流程图,大肠杆菌 肉汤菌种 种子 菌种 发酵液 菌体 提 取液 上清液 沉淀 洗脱液 洗脱液 冻干 L-天冬酰胺酶,菌种培养,肉汤培养基37 4
6、8h,玉米浆培养基37 4-8h,种子培养,发酵,玉米浆培养基37 6-8h,离心,提取,蔗糖抽提液PH7.5 30,分级沉淀,（NH4)2SO455饱和度PH7.0,分级沉淀,（NH4)2SO490饱和度,离子沉淀,DEAE-纤维素(DE52),离子交换,CM-纤维素(CM52),工艺过程及要点,1 菌种培养 采用大肠杆菌Escherichia coli A.S.1.357,培养基加牛肉汁100mL,蛋白胨1g,氯化钠0.5g,琼脂2-2.5g 37,在试管中培养24h，茄形瓶培养8h，锥形瓶培养16h。 2 种子培养 培养基用玉米浆30kg，加水至300kg，接种量1%-1。5%，37，通
7、气搅拌培养4-8h.,一、总述,3 发酵罐培养 取玉米浆100Kg，接种量8%，37，通气搅拌培养6-8h，离心分离发酵液，得菌体加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉。 4 蔗糖溶液抽提 将菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖溶液（蔗糖40%溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,PH7.5),30振荡2h,8000r/min离心，收取上层酶液。,5 硫酸铵分级沉淀 取上述酶液，加入（NH4)2SO4至55%饱和度，调PH至7.0，室温搅拌1h，离心除去沉淀，取上清液加入（NH4)2SO4到90%饱和度，离心收集沉淀。 6 纯化 将沉淀用50mmol/L,PH7.0磷酸缓冲液溶
8、解并透析，透析后的酶液，通过预先用10mmol/L，PH7.6磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素层析柱（1cm30cm）,用30mmol/L磷酸缓冲液洗脱，流速为40mL/h,收集天冬酰胺酶活性组分，再调整PH4.8,通过预先用50mmol/L,PH4.9的磷酸缓冲液平衡的CM-纤维素层析柱（1cm8cm）,用50mmol/L,PH5.2的磷酸缓冲液洗脱，收集酶活性组分，冷冻干燥，即得L-天冬酰胺酶冻干粉，总收率为31%，比活为220U/mg蛋白。,二、工艺流程图,（1）丝状菌三级发酵工艺流程 冷冻管（25C，孢子培养，7天）斜面母瓶（25C，孢子培养，7天）大米孢子（26C，种子培养56h）一
9、级种子培养液（27C，种子培养，24h）二级种子培养液（2726C,发酵,7天）发酵液。 （2）球状菌二级发酵工艺流程 冷冻管（25C，孢子培养，68天）亲米（25C，孢子培养，810天）生产米（28C，孢子培养，5660h）种子培养液（2625-24C，发酵，7天）发酵液。,三、青霉素发酵过程,青霉素发酵时，青霉素生产菌在合适的培养基、PH、温度和通气搅拌等发酵条件下进行生长并合成青霉素。 发酵开始前，有关设备和培养基（主要是碳源、氮源、前体和无机盐等）必须先经过灭菌，后接入种子。 在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和罐压，在发酵过程中往往要加入泡沫剂，假如酸碱控制发酵液的PH，还需要间歇或连续的加入葡萄糖及铵盐等化合物以补充碳源及氮源，或补进其他料液和前体等以促进青霉素的生产。,青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长、青霉素合成和菌体自溶三个阶段。,菌体生长阶段：发酵培养基接种后生产菌在合适的环境中经过短时间的适应，即开始发育、生长和繁殖，直至达到菌体的临界浓度。 青霉素合成阶段：这个阶段主要合成青霉素，青霉素的生产速率达到最大，并一直维持到青霉素合成能力衰退。在这个阶段，菌体重量有所增加，但产生菌的呼吸强度一般无显著变化。 菌体自溶阶段：这个阶段菌体衰老，细胞开始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生产速率下降，氨基氮增加，PH上升。,