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1、实验三 药敏,实验内容,一、纸片扩散法（K-B法） 二、稀释法 (MIC),实验目的,一、掌握纸片扩散法的原理、操作方法、结果的判断及其临床意义。 二、掌握纸片扩散法的质量控制(采用标准菌株控制可变因素)。 三、掌握肉汤稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作方法、结果判断及临床意义。 四、了解稀释法的质量控制(采用标准菌株控制可变因素)。,纸片扩散法（K-B法）,器材与试剂 菌种： 金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色葡萄球菌临床种的6小时肉汤培养物，调整浓度至0.5麦氏比浊管（相当于1.5108CFU/ml)；或挑新鲜培养的单个菌落，在无菌生理盐水中研磨，校正其浓度至0.5麦氏比浊管。 培养
2、基：水解酪蛋白培养基（MH琼脂）。 其他：无菌棉签、抗菌纸片、镊子、直尺等。,原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解，不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。,方法:（4人一组，2人做金葡菌标准种，2人做临床种，每种菌选4个不同的药物纸片） 1、制备MH琼脂平板：将加热融化的琼脂冷却至60左右时倾注于直径为9cm的无菌平板中，使琼脂厚度为4mm，待琼脂凝固后使用，如有冷凝水产生，可放置37 温箱中15-30分钟后使用。 2、无菌棉签蘸
3、取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在平板表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60，最后沿平板內缘涂布1周。 3、平板在室温下干燥5分钟，用无菌镊子将抗菌药物纸片贴于琼脂表面，各纸片中心相距大于24mm，距平板內缘大于15mm， 37 温箱中孵育16-18小时，量取抑菌圈直径。,结果观察中的注意事项： 1、准确量取抑菌圈直径，若抑菌圈为椭圆形，量其最长径和最短径，取其平均值。 2、若出现双层抑菌圈，一般药物测量内圈，而磺胺类药物则量其外圈。 3、若抑菌圈内有散在菌落出现，排除污染菌的存在和其他影响因素，若无污染菌等，需重做。,结果观察： 1、结果解释：用毫米尺量取抑菌圈直径，参照书上的标准判读结
4、果。按敏感（S）、中介（I）、耐药（R）报告。 例如：抗菌药物丁胺卡那霉素（AMK），每张纸片含药量30微克，抑菌圈14mm为耐药，15-16mm为中介，17mm为敏感。 2、质量控制：标准菌株的抑菌圈应落在书上的预期范围内，如果超出该范围，应为失控，而不发报告，应及时查找原因，予以纠正。 例如：抗菌药物丁胺卡那霉素（AMK），每张纸片含药量30微克，金黄色葡萄球菌ATCC标准株的抑菌圈应在20-26mm之间。,思考题： 影响因素？ 1、培养基的质量：双层抑菌圈的出现？ 2、纸片质量 3、接种细菌的菌量 4、孵育的温度和时间 5、操作因素,稀释法,微量稀释法 常量稀释法（试管稀释法）,常量稀释
5、法（试管稀释法）,1、实验目的： 用于测量某种药物对测试菌的最小抑菌浓度（MIC） 2、实验原理： 将抗菌药物混合于肉汤中作一系列的稀释，再加入定量的测试菌，经一定时间和温度培养后，无细菌生长的最低药物浓度即为该药对此菌的MIC。,定量的测试菌的制备,1、将金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色葡萄球菌临床种的6小时肉汤培养物，调整浓度至0.5麦氏比浊管（相当于1.5108CFU/ml)；或挑新鲜培养的单个菌落，在无菌生理盐水中研磨，校正其浓度至0.5麦氏比浊管。 2、将调好浊度的菌液用无菌肉汤稀释10倍，即可使用。,步骤和方法,将抗菌药物用肉汤稀释成不同浓度，加入定量测试菌。 编号 1 2
6、 3 4 5 6 7 8 9（对照） 无菌肉汤管 1.8 1 1 1 1 1 1 1 1 （ml） 青霉素 0.2 1 1 1 1 1 1 1 弃去 (80单位） 稀释的金葡菌0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 （ml) 37培养16-18小时,结果观察: 完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为该抗菌药对此菌的MIC。 此次实验即为青霉素对金黄色葡萄球菌ATCC株和临床株的MIC。 结果举例：,编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 无菌肉汤管 1.8 1 1 1 1 1 1 1 1 （ml） 青霉素 0.2 1 1 1 1 1 1 1 弃去 (80单位） 金葡菌 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 结果 细菌生长 - - - - - + + + + 青霉素浓度 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 对照- 结果判断:抑制肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对检测菌的MIC,影响因素？临床意义？,