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1、实验二 革兰氏染色及真菌形 态结构观察 一、实验目的 学习细菌的革兰氏染色原理和方法 了解霉菌、酵母菌的特点并观察其形态特征 二、实验原理 单染色法：只能观察微生物的大小、形状 、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以 及它的特殊构造等。 复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、荚膜染色法、芽孢染色法 、鞭毛染色法等。 (一) 革兰氏染色 丹麦C.Gram创立，用于细菌分类学研究 细菌细胞壁的结构 G肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂 质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了 类脂质，增加了细胞的通透性，使初染 的结晶紫和碘的复合物
2、易于渗出，经沙 黄复染呈红色。 G细胞壁结构致密，用脱色剂处理后， 肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细 菌仍保留初染时的紫色。 (二) 了解霉菌、酵母菌的特点 并观察其形态特征 三、实验材料 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（24h培养物） 革兰氏染色液一套 真核微生物标片 四、实验步骤 革兰氏（Gram）染色法 1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸 铵结晶紫染液，染1分钟，倾去 染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲 去残水，而后用其覆盖涂面1分 钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒 精进行脱色约1520秒，后立即 用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液
3、，染35 分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。 注意事项 1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色 过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性 菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被 染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂 片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以 严格规定。 2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后 ，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀 释而影响染色效果。 3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h， E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死 亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应 。 观察酵母菌形态和无 性繁殖： 用高倍镜观察啤酒酵母的 形态和出芽繁殖。 观察黑根霉菌丝情况和子囊孢子情 况（着重辨认孢子囊、包囊梗、假 根）： 观察青霉菌丝和分 生孢子着生情况： 1.单轮生青霉群；2.对称二轮 生青霉群；3.多轮生青霉群； 4.不对称生青霉群 观察黑曲霉菌丝分隔情况和分生孢子着 生情况（着重辨认分生孢子梗、足细胞 和分生孢子）： 五、实验结果 记录所观察到的二种菌革兰氏染色结果 的差别，并判断是阳性还是阴性 观看根霉菌、青霉菌、曲霉菌与酵母菌 的示范片 绘图、写实验报告 六、问题与讨论 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意 哪些操作？哪一步是关键？Why? 本次实验课结束 请确保油镜头擦拭干净！ 下周再见！