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1、实验二,培养材料消毒和接种,一、实验目的 1、掌握植物组织培养中的无菌操作技术 2、掌握植物外植体表面消毒的常规方法,操作前的准备工作 接种室在接种前4-5 d必须通风换气。在接种前一天对接种室进行全面消毒，一般用40%福尔马林进行全面喷雾，并密闭24 h，然后打开换气窗10-15 min.。,A: 实验器具和材料的准备 B: 用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。 C: 关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特
2、别情况，尽量不要下工作台）,D: 用7075乙醇消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。 注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。,接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中,错 误,整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速,正 确 错 误,接种过程中尽可能达到悬空要求,防止操作带来的污染,正 确 错 误,培养器材的清洗与灭菌 在细胞工程实验中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。毒性物质包括解体的微生物和细胞残余物以及非营养的化学物质。某些化学物质仅0.01g/L就
3、会对细胞产生毒性作用，因此对培养器皿的清洗是组织培养中一项极为重要的环节。,A、新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用0.5的去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在12盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在100120烘箱内烘干备用。,B、使用过的玻璃仪器的清洗 先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用。 清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗. C、金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥,（1）干
4、热灭菌 适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：150 、40min （2）湿热灭菌 适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。121 维持2030min,（3）过滤灭菌 培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。 灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至50左右时，加入适量的激素。,（4）射线灭菌 主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间20-30min。 注意：关灯后5min后再进入。超净工作台关灯后要打开风机 、 （5）火焰灼烧灭菌 用火焰灼烧达到灭菌目的，
5、适用于接种器皿的灭菌。,（6）消毒剂 适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。 几种常用消毒剂的效果比较,二、实验原理 用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组织培养中，外植体如果是带菌的，在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养成功的最基本的和重要的前提。常用消毒剂对外植体进行消毒。从室外取的材料，一般先用自来水冲洗数分钟.,接种材料使用消毒剂后，要用无菌水洗涤35 遍，最后用无菌纸擦干净。使用消毒剂的原则是既要达到消毒目的，又不能损伤植物组织和细胞，还要符合就地取材的原则。对一些容易污染、较难灭菌的外植体进行表面消毒时，用单一消毒剂不能收到好的效果，所以常选用两种消毒剂交替浸泡法
6、。,一般，首先用75乙醇浸泡外植体数秒钟至30s，然后置于0.1氯化汞溶液510min 或含有2活性氧的次氯酸钠溶液530min，然后用无菌水洗涤。有时在氯化汞或次氯酸钠灭菌后，用无菌水洗，进一步剥去几层组织或器官如叶片后，再用次氯酸钠灭菌35min，无菌水漂洗3 次后，切割、用于接种。 消毒溶液对外植体消毒是在超净工作台上进行。完成表面消毒的接种材料要尽快放置于培养基中。,三、实验材料 器材： 超净工作台、镊子、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿。 药品及材料： 0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、绿豆种子、培养基。,四、实验步骤 （1）准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。 （2）将
7、培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关，照射至少20分钟，关闭台内的紫外灯，通风五分钟后，再开日光灯进行无菌操作。 （3）接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。 （4）将绿豆种子在流水下冲洗干净。,（5）将种子放于广口瓶中，用75%的酒精溶液浸泡30s，无菌水冲洗，然后用0.1%升汞溶液浸泡3、5、10min，期间不断摇动溶液，用无菌水洗涤5遍待用。 （6）取出培养皿，有必要的话可以用沾有75%的酒精的棉球把皿表面擦一下。,（7）接种用的镊子使用前插入95%的乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧片刻，冷却后待用。也可以插入培养基边缘促使其冷却。,（8）在酒精灯火焰旁揭去培养皿封口膜，在靠近火焰处，右手用灭菌的镊子夹取绿豆种子，将其放在培养基上，用镊子轻轻按一下，使其部分浸入培养基。每瓶可放8-12个外植体。 （9）封上封口膜，标上接种日期、材料名称、姓名等，将接种材料移到培养室培养。,五、作业 1、观察接种后25天的污染情况，填入下表,2、在接种过程中，通过哪些措施来防止细菌对接种 工具，接种材料的污染？,