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1、实验四 DNA回收纯化及重组体的构建,实验目的和要求 学习和掌握从PCR产物中回收DNA片段的方法。并了解从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的有关技术。 本实验采用粘末端连接法将PCR扩增的DNA片段插入到pBluescript KS质粒载体中，掌握DNA重组方法。通过本实验了解DNA重组技术在分子生物学研究中的重要意义。,DNA片段的纯化： DNA纯化的主要目的是回收得到纯的目的DNA片段，去除影响DNA连接酶活性的物质以及其它的DNA片段。纯化DNA片段的方法有多种，如：电洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接从 PCR产物中或琼
2、脂糖凝胶中回收DNA片段的试剂盒，有效地加快了DNA的纯化的速度。,相关基础知识,DNA重组本质上是一个酶促生化过程，是指将外源目的基因片段通过DNA连接酶的的作用插入到质粒载体中的过程。DNA片段只有与载体重组并转入合适的宿主细胞中才能进行复制。通过此方法可以对单个基因的功能进行研究。结合PCR技术还可以应用于疾病诊断、合成具有商业意义的产品，如胰岛素、干扰素等。,DNA重组,因为载体具有能够在特定宿主细胞中独立自我复制的复制起始点，保证插入的外源片段的复制；并且具有多个限制性内切酶的单一位点，即多克隆位点，用于插入外源片段，而又不破坏质粒本身的结构；还具有易于筛选和检测的标记性基因，如抗药
3、性基因、酶基因或营养缺陷型等。但针对不同的研究目，选择的择载体也是不同的，不仅要考虑上述特性，而且还要考虑所选载体是表达载体还是非表达载体、是真核生物表达载体还是原核生物表达载体以及酶切位点等方面的问题。,载体的选择：,主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。E. coli DNA 连接酶催化DNA分子连接的机理与T4噬菌体DNA连接酶基本相同，只是辅助因子不是ATP而是NAD+。T4噬茵体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步。,DNA连接酶,T4噬菌体DNA连接酶还有一种E. coli DNA连接酶没有的特性即将两个平末端的双链DNA分子连接起来的功能。对于这种连接反应的
4、机理目前还不清楚，总的来说这种连接的效率比粘性末端的连接效率要低得多，可能是因为平末端DNA分子无法形成类似粘性末端分子那样的相对稳定的结构。,Weiss单位（Weiss等,1968），是指在37oC下20分钟内催化1nM 32P从焦磷酸根置换到,-32P ATP所需酶量； （NEB公司，粘性末端）将1g由HindIII酶解的DNA的12碱基对粘性末端在160C条件下、30分钟、20l反应体系中连接50时所需酶量。 (Takara公司)在20l的反应体系中，6g的DNA-HindIII的分解物在160C反应30分钟时，有90以上的DNA片段进行连接的酶的活性为1U。 相当于 ATP-Ppi交换
5、反应中0.008 Weiss U。,对于T4-噬菌体DNA连接酶的活性测定至少有三种以上的方法：,连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是37，此时连接酶的活性最高。但37时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即1216。 DNA的连接主要有粘性末端和平端连接法，这些主要根据外源片段的末端性质、质粒性质以及两者的酶切位点来确定。,连接,粘末端连接法 若DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末端包括相同内切酶产生的粘性末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端。相
6、同内切酶产生的粘末端连接得到的重组质粒能够保留接合处的限制酶切位点，因此可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。而不同酶产生的粘性末端连接得到的重组质粒不能够保留接合处的限制酶切位点，因此不可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。以上两类粘性末端的连接方法都很重要。,另外，当用单酶切时，虽然产生了互补的粘性末端，但由于载体存在自连现象，也会降低正确插入的频率。通过一些处理可以减少自连现象的发生。常用的方法是用小肠碱性磷酸酶(CIP)去掉载体5-磷酸来达到抑制DNA片段的自身环化的目的。 综上所述，在进行基因重组时，一般采用插入片段及载体两端具有两个相应的能够产生粘性
7、末端的酶进行酶切后重组，如插入片段和载体的一端为EcoR I ，另一端为BamH I，它们都能产生粘性末端，不仅易于连接，而且又不能互补，所以能够得到较好的重组结果。,平端连接法： 待插入片段的平末端主要由两方面来源，即由酶切后产生的平端和补平后产生的平端。一般由酶切产生的平端较易连接。但在试验过程中，往往会遇到插入片段和载体之间没有互补的末端，这时，就需要将末端进行“补平”或去除3突出端，然后再用T4噬菌体DNA连接酶连接两个平端。不过，平端连接的效率是比较低的，一般通过提高DNA的浓度或增加连接酶的用量可提高平端的连接效率，有时也可采取在平端加上合成的接头的方法，产生粘性末端，也可以提高连
8、接的效率 。,适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用载体：插入片段摩尔数为1：2-3的比例。,载体及插入片段的量,实验材料与仪器： PCR产物(0.8kb，带有BamHI、 HindIII酶切位点) pBluescript KS 质粒(3.0kb) NEB 1kb 标准分子量片段 BamHI、 HindIII限制酶及 10K buffer 琼脂糖 T4 DNA ligase 及其缓冲液(Takara) TBE缓冲液(10) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 上样液(3),电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等,实验方法和步骤,PCR产物的纯化-PCR
9、产物以及空载体的酶切-乙醇沉淀-电泳检测-连接-160C过夜,A 从PCR产物中直接回收纯化DNA (Promega 公司) 直接加100l纯化缓冲液于1.5ml离心管，再加入30300l PCR反应物，Vortex混合； 加入1ml树脂轻轻Vortex 3次，每次间隔1分钟； 进入C步骤。,DNA回收纯化步骤： 回收PCR产物常采用两中方法，即直接回收和从凝胶中回收，目前有许多公司出售相关的试剂盒。,B 从琼脂糖凝胶回收纯化DNA 用琼脂糖凝胶分离PCR片段，用UV观察EB染色条带； 用干净的刀片切出所需DNA条带，注意要在长波长（300nm）UV灯下操作，并快速操作，以免损伤DNA。应尽可
10、能多地去除琼脂糖凝胶，一次操作可切取多至300mg的条带；,将300l (300mg) 琼脂糖条片转移至1.5ml离心管。直接在70温育直至凝胶全部溶化（一般可按公司提供的说明书进行）； 加1ml树脂，彻底混合20秒，但不用Vortex； 下接C步骤。,C 纯化步骤 将取出拉杆的注射器筒（3ml）装在纯化柱上，加入上述DNA与树脂混合液，然后装上拉杆，慢慢将混合液推进纯化柱内； 卸下注射器筒，拔出拉杆，再将注射器筒装上纯化柱，加2ml 80%的Isopropanol, 然后装上拉杆，慢慢推出液体以清洗柱子；,再次卸下注射器筒，将纯化柱装在1.5ml离心管上，10000g离心2 min，以干燥树
11、脂； 再将纯化柱装在一个新的1.5ml离心管上，加50l水或TE缓冲液，1分钟后，10000g离心20秒，溶出DNA片段； 移去纯化柱，将纯化出的DNA溶液在-20下保存备用。,D 说明 若向1ml树脂中加入500bp PCR产物50ng至16g，其回收率可在95以上。同样500bp，若从低溶点琼脂糖凝胶中回收其回收率在7090之间。,学生PCR实验结果(4l),PCR 产物纯化后(相当于0.8 l原PCR产物）,pBluescript 酶切后,PCR 纯化并酶切后 (2l),DNA重组,本实验是将具有BamHI和HindIII粘性末端的基因片段以及载体通过DNA连接酶连接起来。,方法1（酶切
12、后乙醇沉淀，适于PCR产物的重组）： 在灭菌的 Eppendorf 管中加入制备pBluescript KS空载体0.2-1g(针对本实验，取4l约800ng)，2 l 10酶切缓冲液， BamHI & HindIII酶各1l（各5单位），用无菌双蒸水加至20l 反应体系，于37保温1-3h； 在另一管中加入待插入的DNA片段（纯化的PCR产物）0.2-1g(本实验约为4-10l)，2l 10酶切缓冲液，HindIII 和 BamHI酶各1l（各5单位），用无菌双蒸水加至20l 反应体系，于3 7保温 1-3 h ；,操作步骤,(根据实验情况而定，完毕后各取3l酶解液做电泳分析，观察酶解是否完
13、全）将酶解液加入2倍体积的100乙醇以及1/10体积的3M NaAC(pH=5.2)，置-20冰箱 30min。4oC，12,000rmin离心 10 min，弃上清，加入100l 70乙醇(洗涤沉淀物)，离心去上清，室温干燥DNA 沉淀15分钟左右，加入 10 l 水或TE缓冲液溶解DNA； 完毕后各取2l DNA做电泳分析，0.8%琼脂糖凝胶，进行初步定量（同时还可以观察载体的酶切结果）。,将酶切后的 2个DNA片段（有时需要在70oC加热15分钟使酶失活及酚氯仿抽提），然后按载体：待插入DNA片段1：2（摩尔）混合于一管中（载体可用50-100ng，对于本实验约1 l载体，2 l DNA片段，根据电泳结果来判断 ） ，加入T4 DNA连接酶缓冲液1l，最后加T4噬菌体DNA连接酶1l(5单位)，一般掌握在总体积10 l，于16保温 1416h（过夜）， 应迅速作转化实验，如遇到特殊情况，可先置于-20oC保存。 然后，通过转化细菌来鉴定反应连接产物。,将质粒按照方法1所述过程进行酶切、电泳鉴定，然后将酶切后的载体以及目的片段从凝胶中回收纯化，将纯化后的产物按载体：待插入DNA片段1：2（摩尔）混合于一管中，之后按方法1中的过程进行连接、转化等。,方法2 （需要酶切后纯化，可以用于从一个质粒亚克隆到另一个质粒） ：,