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1、思考题1：培养基配置好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是否为无菌的？ 思考题2：如果需要配制一种含有某抗生素的固体培养基，其中抗生素的终质量浓度（或工作浓度）为50ug/mL，你将如何操作？（提示：抗生素在高温下易失效）,实验四 革兰氏染色法,目的要求,学习并掌握革兰氏染色法。 了解革兰氏染色原理。 巩固显微镜的使用方法及无菌操作技术。,菌种 参考菌：金黄色葡萄球菌(G+), 大肠杆菌 (G-) 待测菌：蜡样芽孢杆菌、蓝细菌(微囊藻) 仪器 显微镜 材料 载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、染色缸等 染料 草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、0.5%番红染色液,制片
2、初染 媒染 脱色 复染 镜检,主要操作步骤,制片,要用活跃生长期的培养物进行革兰氏染色; 注意练习无菌操作； 在载玻片上滴一小滴生理盐水； 取菌不要贪多，接种环上肉眼可见菌苔痕迹即可； 菌苔在生理盐水中涂片要均匀，局部不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性 涂片-室温干燥-固定,初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。 媒染 滴加碘液冲去水迹，再染1-2min，水洗。 脱色 吸水纸吸去多余水分,滴加95%乙醇，脱色20-30s立即水洗，以终止脱色。 复染吸水纸吸去多余水分,滴加番红，染色2-3min，水洗。最后用吸水纸轻
3、轻吸干。,干燥后，置显微镜下观察。 被染成蓝紫色者即为革兰氏阳性菌(G) 被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-),革兰氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较,成分 占细胞壁干重的% 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 肽聚糖 含量很高（50-90） 含量很低（10） 磷壁酸 含量较高（50） 无 类脂质 一般无（ 2） 含量较高（20） 蛋白质 无 含量较高,G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。 G菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层失水、孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，即结晶紫的蓝紫色。,作 业,结果 简述4种细菌的染色结果（形态、颜色、革兰氏染色结果） 思考题 84页，思考题1、2、4,下一次实验:细菌的芽孢染色和荚膜染色,