微生物学8.ppt

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1、第八章 微生物遗传学,第一节 遗传的物质基础及其特性 第二节 遗传信息的表达 第三节 细胞中遗传信息的变异 第四节 微生物的诱变育种和遗传工程,何谓遗传学？ 遗传学是关于遗传物质的生理生化性质、世代传递方式，以及所携带的信息在个体发育中的表达的一门科学。 早期的遗传学研究亲代与子代之间遗传性状的传递，提出了遗传的染色体理论，对基因进行了作图，并发现了基因重组现象，故名传递遗传学。 近代的遗传学则进一步从分子水平上研究基因的构成、复制、表达、突变和修复等，被称为分子遗传学。,微生物遗传学 涉及部分真核生物，所有的原核生物，以及病毒的遗传； 介绍微生物的遗传物质的结构特点、遗传信息的表达与调控、遗

2、传变异的基本规律； 介绍通过基因操作改变微生物的遗传信息从而有效地控制或利用微生物的基本策略。,第一节 遗传的物质基础及其特性 一、遗传物质的鉴定 二、脱氧核糖核酸 三、基因组DNA和染色体 四、染色体以外的遗传因子,经典试验1. 肺炎链球菌的转化试验 图8. 1（a）S型和R型细胞侵染试验,一、遗传物质的鉴定,分离后的S型细胞物质对R型细胞的转化 图8.1（b）,结论,细胞生物的遗传物质是双链DNA 病毒的遗传物质可以是单链的或双链的DNA或RNA， 即：ssDNA，dsDNA，ssRNA或dsRNA。,二、脱氧核糖核酸,1核酸的化学组成和结构 2DNA的复制方式 3DNA的理化性质,1核酸

3、的化学组成和结构,Watson 和Crick在1953年描述了DNA的结构模型： DNA分子是由两条相互平行、方向相反的多核苷酸单链以右手螺旋方向相互缠绕而形成的双螺旋。 脱氧核糖和磷酸构成的主链位于外围，通过氢键相互交联的碱基处于双螺旋的内部。 腺嘌呤与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对；两条单链互补；一条链的碱基序列限定了另一条链的序列。,Rosalind Franklin 的贡献,Watson and Crick proposed DNA structure in 1953 by building models based on chemical and physical data tha

4、t had been gathered in other labs, primarily x-ray diffraction data collected by Rosalind Franklin et al.,2DNA的复制方式,细菌DNA的q-形复制 真核生物DNA的复制,10100 mm,复制叉,复制叉,复制原点,模板 新生链,DNA的滚环复制模式,图8. 2,切口,5,5,3,3,3,模板 新生链,新链连续复制,互补链合成,3DNA的理化性质 DNA的稳定性 在溶液中，DNA具有一定的粘性，易受剪切力的破坏；易被核酸酶降解； 在强酸中，DNA能被水解成碱基、糖和磷酸； 在特定的稀酸中(

5、如pH 34)，不同碱基与核糖之间的糖苷键会发生特异性的断裂，根据这种特异性可测定DNA的碱基序列； 在稀碱如0.2当量NaOH中，双链DNA很快变性产生单链DNA，继而单链DNA被进一步破坏。,3DNA的理化性质（2） DNA的光学性质 DNA中的碱基属于芳香簇化合物，能够吸收紫外光(UV)。DNA吸收峰的光波波长为260纳米；当浓度为 1 mg/ml时， dsDNA ： A260=20 ssDNA、RNA ： A26025 人们根据A260测定DNA的浓度， 根据A260 / A280和估算DNA的纯度。,3DNA的理化性质（3） DNA的热变性 双链DNA在一定的高温下解链(变性)产生单

6、链DNA。双链DNA完全解链后，紫外吸收值A260可以提高 40，当吸收值的提高达到中点时的温度称为解链温度（Tm）。,1.4 1.2 1.0,70 80 90 100C,Tm,3DNA的理化性质（4） 复性、退火或杂交 当温度缓慢降低时，序列互补的单链DNA能够渐渐地重新配对，即复性。 不同来源的DNA之间碱基序列互补的区段进行的碱基配对称为退火或杂交，这被广泛应用于DNA的扩增、定点诱变、基因鉴别。,3DNA的理化性质（5） 分子特征与微生物分类鉴定 DNA中的GC含量通常通过Tm值来测定。同一个属的细菌， GC含量的变化一般小于10。 DNADNA杂交技术用于研究亲缘关系近的微生物。 如

7、果两菌株在最适条件下杂交，DNA相关性70%，且Tm值差别5，它们就被认为同种。,三、基因组DNA和染色体,基因组是指一种生物体内单套遗传物质的全部遗传基因。染色体指携带细胞功能所必备的基因的遗传单元。 病毒是非细胞生物，它们的全套遗传基因称为基因组，但不足以形成染色体。 原核生物的染色体常为一个环状的DNA分子。 真核生物的细胞有几条至几十条染色体，各含一个线状的DNA分子。,细菌染色体DNA的大小和结构,(a)大肠杆菌细胞大小和染色体DNA长度的比较；(b)细菌细胞中的拟核；(c)大肠杆菌染色体结构电镜图。宽1.11.5 mm、长26 mm的细胞里包装着的一个DNA分子的长度达1 mm；这

8、个环状的DNA分子在细胞中形成含有一个染色体的拟核；在染色体的中心有一个由DNA结合蛋白和膜组成的骨架，DNA分子附着在骨架上形成50100个超螺旋的环，每个环中含碱基对约50100 kb，这种多层次折叠使DNA处于高度压缩状态.,From figures in referenced book 5.,真核生物细胞中的DNA中只有不到5的DNA用于所需蛋白质的基因表达，其余的DNA起“结构”作用或“调节”作用。 DNA被紧密地包装在多条染色体中，每条染色体中含有一个线状DNA分子，它以左手螺旋方向围着一个个组蛋白八聚体绕圈1.8周，形成串珠状的染色质，被串在一起的小颗粒称为核小体，染色质进一步卷

9、曲形成每圈6个核小体、直径30 nm的染色质丝，它折叠成许多超螺旋环附着在中央骨架上。,真核生物的染色体结构,From BIOLOGY by Jack C Carey et al., eds,四、染色体以外的遗传因子,线粒体和叶绿体中含有的DNA能够自体复制，并编码执行线粒体和叶绿体功能的蛋白，属于染色体以外的遗传因子。 质粒一般指存在于细菌、真菌等微生物细胞中，独立于染色体以外，能进行自我复制的遗传因子。质粒的大小为11000 kb，常为环状的双链DNA分子，也有线状DNA或RNA质粒。 有些质粒既能够整合到染色体上，又能以游离状态存在，并能携带部分染色体基因进行转移，它们被称为附加体。,第

10、二节 遗传信息的表达 一、真核生物基因的转录及其调控 二、原核生物基因的转录及其调控 三、翻译过程中的调控 四、调控信号与系统性调控,主要调控机制的调控模型 图8.5,一、真核生物的基因转录及其调控 1. 真核生物的基因转录 常见启动子是位于转录起始位点上游2530个碱基对的TATA盒；另一些基因则含有一个与转录起始位点重叠的起始元件。 RNA聚合酶催化合成的是 Pre-RNA，它必须经过加工才形成成熟 mRNA。 Pre-RNA的加工在细胞核中进行，主要加工步骤：5端加帽、3端加尾、剪接去除插入子等。,发生在pre-mRNA转录的早期，当新生RNA分子长度达到2530核苷酸时，加帽酶使新生转

11、录物的5端第一个核苷酸(A或G)g位的磷酸水解，并加上7-甲基鸟苷三磷酸。,2. 5端加帽反应和帽子结构,图8.8帽子结构：5端第一个核苷酸是7-甲基鸟苷三磷酸，它以5三磷酸酯键与第二个核苷酸的5端相连，而不是通常的3,5磷酸二酯键。,甲基,3. 3端的加尾过程 3端加poly(A)发生于插入子剪切之前。 Pre-mRNA的尾部具有非编码区，其3端约20个核苷酸之前有一个称为多聚A位点的序列AAUAAA。 特异性的核酸内切酶识别多聚(A)位点后，切除其后面的20个核苷酸并产生3端游离羟基。 在poly(A)聚合酶的作用下， 20250个腺嘌呤核苷酸被加到3端，产生poly(A)。,pre-mR

12、NA中有编码和不编码蛋白质的序列相间排列，其中不编码蛋白质的序列被称为插入子；编码蛋白质的序列被称为表达子。,4. 剪接去除插入子,插入子的切除和表达子的拼接,自参考书,2,5. 真核生物基因转录的调控 真核生物基因表达的调控作用可能发生在转录、mRNA修饰和稳定、翻译、mRNA的转运和降解等各个步骤。 真核细胞中基因表达的调控信号包括两类：一类是激素和蛋白质分子，另一类是外环境因素。,二、原核生物基因的转录及其调控 1. 细菌的基因转录过程 mRNA不需要加工，转录与翻译同步。 启动子：在10和35区具有特征性的序列，被不同的因子所识别。 多顺反子：功能相关的多个基因往往聚集成一个操纵子，处

13、于同一个转录单元中。,细菌的转录和翻译同步进行,图片来自参考书2,2. 因子参与的转录调控 细菌RNA聚合酶的核心酶的功能对任何基因都一样，而因子才是选择转录对象的关键亚基。 每一种因子识别的启动子在10和35区都具有特征性的序列。 10和35区不仅被不同的因子所识别，而且是决定启动子强度。,例：大肠杆菌 在正常生长条件下，分子量为70 kDa的70指导RNA聚合酶的活动； 当细胞需要进行趋化移动时，就产生分子量为28 kDa的28启动鞭毛和趋化蛋白的合成； 如果环境温度突然上升，细胞会产生分子量32 kDa 的32启动热休克蛋白基因的转录以保护细胞不受高温伤害，并清除已变性的蛋白。,3. 操

14、纵子和转录的正、负调节 在原核细胞中，几个功能相近或相关的结构基因经常有序地排列在一起，并被转录在同一个RNA分子上；这种由一个转录控制区和1至多个结构基因组成的一个完整的转录单元称为操纵子。 有些基因需要在活化蛋白结合到DNA的特定位点后才能有效表达；由活化蛋白激活或促进基因转录的调控方法叫做转录的正调节。 由阻遏蛋白结合到DNA的特定位点上，对转录的起始发生阻遏或解阻遏作用，这种调控方法被称为转录的负调节。,例：乳糖操纵子的结构 图8.6 其中有两个调控基因： （1）阻遏蛋白的结合位点Oprator，乳糖参与负调节； （2）激活蛋白CAP的结合位点，cAMP参与正调节。,参考书1,衰减作用

15、是通过衰减子使已经开始的转录提 早终止，从数量上减少完整mRNA的产生。图8.7,4. 衰减作用,三、翻译过程中的调控 固定式的调控：包含在DNA序列之内，如稀有密 码子和重叠基因等，其调控不受环境影响。 非固定式的调控：作用受环境因素的影响，与 DNA 序列无关。 稀有密码子出现频率 基因的重叠排列 SD序列、与起始密码子的间距 mRNA形成的二级结构 反义RNA的存在,影响翻译速度的因素,四、调控信号与系统性调控,微生物必须对生存条件的变化迅速作出反应；必须与其它个体或群体进行竞争，获取并有效地利用营养物质。,必须能够产生、感应、传递信号，同时对多个相关的操纵子进行系统性调控。,1. 葡萄

16、糖效应及其机理,当培养基中同时有葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖存在时，大肠杆菌首先利用葡萄糖，直到葡萄糖快要消耗完毕，其它糖的代谢才能开始，这种由葡萄糖的代谢抑制其它糖代谢现象称为代谢抑制（catabolite repression）或葡萄糖效应。,代谢抑制机理,细胞大量摄入并代谢葡萄糖，cAMP的含量随之降低，使受cAMP正调控的乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、麦芽糖操纵子等都不能被激活。 缺乏葡萄糖，或者人为地向培养基中加入cAMP，细胞中cAMP的浓度升高，产生的cAMP-CAP复合体与DNA结合，激活代谢乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖的操纵子。,2. 严紧反应,细菌在生长过程中如果得不到足够的氨基

17、酸，细胞内鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸(pppGpp)的含量迅速上升；与此同时，RNA的合成速率迅速降低，蛋白质的合成也随之下降，从而细胞处于低速代谢和缓慢生长状态。当环境中出现足够的氨基酸时，pppGpp和ppGpp被迅速降解，RNA和蛋白质的合成很快恢复。这是在困难时期获得生存的策略，被称为严紧反应（stringent control）。,3. 菌量感应系统,有些细菌具有一种能够感应自身细胞群体密度并对其作出相应的应答反应的调控系统。 这些细菌在生长过程中释放某种信号分子，当细胞群体密度达到了一个临界水平时，信号分子积累到起诱导作用的浓度，从而激活目标操纵子，这种调控叫做菌量感应作

18、用(quorum sensing)。,4. 双组分磷酸接力系统,双组分磷酸接力系统又名双组分信号传导系统，是一种通过磷酰基团的转移来传导信号，并控制基因转录的调节系统。 双组分是：传感蛋白激酶、应答调节蛋白。 双组分系统广泛存在于细菌中，也存在于真核微生物中；高等真核生物也利用磷酸化这一信号传导机制传递信号。,例：枯草杆菌调控芽孢形成的双组分磷酸接力系统,在营养生长阶段，枯草杆菌RNA聚合酶利用A 对与其营养生长有关的基因进行转录；KinA、B、C、D等对环境信号进行传感反应的蛋白激酶，在营养细胞中以非磷酸化的形式存在。当这些激酶感应到不适于生长的信号时发生磷酸化；磷酸化的KinA等将磷酸基团

19、转移到SpoOF；SpoOF将磷酸基团传递给SpoOB； SpoOB再将磷酸基团传递给SpoOA。 磷酸化的SpoOA能与abrB基因的启动子结合并阻遏abrB基因的表达，AbrB是许多基因表达的抑制蛋白； 图8.8 磷酸化的SpoOA能够激活F、E 等Sigma因子的合成。 当细胞内的部分A被F、E 取代时，芽孢开始形成，负责芽孢形成后期基因的转录的G和K逐渐产生。,第三节 细胞中遗传信息的变异 一、微生物的遗传变异现象 二、基因突变的分子基础 三、基因重组 四、原核生物细胞间的基因转移 五、真核微生物细胞间的基因交换,一、微生物的遗传变异现象,自发突变发生的频率很低，观察自发性突变的经典试

20、验是波动试验。 自发突变和诱发突变的本质相同：由于理化因子作用于DNA，导致遗传性状的变化。 少数几个细胞的遗传变异能够使微生物群体完全地改变成新的菌落。 遗传学中常用的突变株包括营养缺陷型、抗药突变型、温度敏感型等。,抗T1噬菌体的大肠杆菌的波动试验 表8.1,艾姆氏试验的基本方法,缺陷型菌株,营养缺乏型平板,37 23天,. . . . . . .,. :. .: : . . ; . ;. . . .:,. :. .: : . . ; . ;. . . .:,. . . . . . .,待测试剂,(图8.10),正常回复突变,诱变剂诱变,艾姆氏试验已成为测试化学物质诱变作用的标准方法， 其

21、原理是检验待测试剂能否使营养缺陷型菌株的回复突变增加。,二、基因突变的分子基础,DNA分子与其它物质发生反应形成非正常结构的现象称为DNA损伤。 DNA损伤的结果是导致基因突变或者细胞死亡。 DNA分子自身的活动能够导致碱基错配；此外，DNA损伤的分子机制都是由已知的或未知的理化因素对DNA的结构产生了破坏作用。,已知的化学致变剂和物理致变剂 物理致变剂 致变剂 电离辐射、紫外辐射等 化学致变剂 脱氨剂、烷化剂、 大型加合物供体、碱基类似物、 插入剂、交联剂。,常见的致变剂及其致变作用 图7.11,亚硝基的脱氨作用；(b) 烷化剂和被甲基化的碱基； (c) 5-溴脱氧嘧啶与鸟嘌呤配对。,嘧啶碱

22、基受紫外辐射后产生的衍生物 图7.12,分子的变异与信息的变化,三、基因重组,同源重组是生物中普遍存在的一种基因重组方式，其特点是可以在任何位置、任何两个具有同源序列的DNA分子之间发生，需要类似RecA的蛋白参与。 位点特异性重组依赖于小范围同源序列的联会，特点是需要在供体和靶分子中包含特定的DNA序列，并且需要特异性的蛋白质因子识别和催化。 转座子是可在一个DNA分子内或不同DNA分子间移动的DNA片段。转座作用即由转座子介导的DNA重排现象，它不需DNA同源性，无RecA参与；转座子的末端带有倒置重复序列，由转座酶识别和切割。,大肠杆菌l噬菌体在特异性位点插入染色体(a)和脱离染色体的方

23、式(b),位点特异性重组 图8.14,转座子的插入和靶序列正向重复的产生过程。,转座作用 图8.15,四、原核生物细胞间的基因转移,在供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受体细胞转移的过程叫做接合作用(conjugation)。 转化(transformation)是指细胞从周围介质中摄取来自不同基因型细胞的DNA，使受体的基因型或表型发生相应变化的过程。 转导(transduction)是由噬菌体介导的将DNA片段从供体菌转移到受体菌的过程。,大肠杆菌中的F质粒及其接合作用 图8.16,大肠杆菌l噬菌体介导的转导 图8.17,(a) 普遍性转导 (b) 特异性转导,五、真核微生物细

24、胞间的基因交换,准性生殖与有性生殖的比较 表8.2,第四节 微生物的诱变育种 和遗传工程 一、菌株的诱变和筛选 二、DNA重组技术的发展 三、基因工程 四、生物种系的遗传改良,一、菌株的诱变和筛选 物理致变剂 致变剂 e.g. X-rays, g-rays, UV 化学致变剂 e.g. base analogs, nitrous acid, alkylating, arylating agents,UVL,VL,Photolyase,例：紫外线诱变的分子基础,紫外线诱变的操作步骤,青霉素生产菌的诱变育种,菌株 NRRL-B25 的诱变过程 Strain Mutagen Yield (U/ml)

25、 Time NRRL-B25 250 1943 NRRL-X1612 X-rays 500 1943 NRRL-Q176 UV light 850 1945 NRRL-WIS-47-1564 UV light 850 1947 - - 50000 1977,对早期生物技术的发展贡献巨大； 适用于途径或基因未得到研究的菌株； 产生的变异程度相对较低； 变异的位点及性质不明； 没有相应的基因就不可能发生新功能。,诱变育种技术的特点,二、DNA重组技术的发展 1. 限制性核酸内切酶 2. 逆转录酶 3. DNA连接酶 4. DNA聚合酶和聚合酶链式反应,1. 限制性核酸内切酶 20世纪60年代末Ar

26、ber 等发现细菌能够产生识别特定的DNA序列并对其加以切割的酶，即限制性核酸内切酶，简称DNA内切酶。这个发现标记着DNA重组技术的诞生。 工具酶识别序列是48个核苷酸，这些位点的显著特点是它们具有双重旋转对称的结构或称回纹结构.,图7.18.(a),限制性核酸内切酶的切割方式 粘性末端：两条单链上的断裂位置交错且对称，所产生的两个末端含有单链的互补序列。 平端切割：两条单链上的断裂位置处在一个对称结构的中心，裂口处两条单链的长短平等。,XhoI,SciI,图7.8. 限制性内切酶切割方式实例 （b）、（c）,2. 逆转录酶 逆转录酶是以RNA为模板合成序列与其互补的DNA链。1970年，科

27、学家发现逆转录病毒以逆转录酶合成它们RNA基因组的DNA拷贝。 以53方向合成DNA ，前提条件：有一段引物、一条模板分子、四种脱氧核糖核苷酸、镁离子。,3. DNA连接酶 DNA连接酶是一种能够催化DNA中相邻的3-OH和5-磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA拼接起来的一种酶。 1972年，David Jackson等使DNA片断的粘性末端退火（即碱基彼此配对），然后用DNA连接酶共价连接这些片段；同年内，他们就发展出基因克隆中所需要的质粒载体与外源DNA的连接技术，成功地获得了重组DNA分子。,4. DNA聚合酶和聚合酶链式反应 DNA聚合酶在有一条DNA单链为模板和一段寡核苷酸

28、为引物的条件下，催化与模板互补的另一条DNA新链的合成反应。1985年Kary Mullis等用DNA聚合酶创建了聚合酶链式反应(PCR)；用该技术进行特定DNA片段的体外扩增，可以在短时间内获得数百万个特异序列的拷贝。 由于PCR技术对现代生物技术发展的巨大贡献，发明人获得了诺贝尔奖。,来自极端微生物的 热稳定性 DNA polymerase,如来自 Thermus aquatcus 的 Taq polymerase 95C，半衰期 2 h 使PCR实现自动化。上图为PCR仪，下图为示PCR循环。,T (C) 90 70 50,Time (min),循环 1 循环2 循环3 循环,三、基因工

29、程 1. 基因工程总体策略 2. 目标基因的克隆与鉴定 3. 宿主和载体 4. 重组蛋白的生产,1. 基因工程总体策略（1） 基因工程指用人为的方法将所需要的某一供体生物的DNA提取出来，在适当的条件下用适当的酶切割后，把它与载体DNA分子连接起来形成具有自我复制能力的DNA分子复制子，并将它转移到宿主细胞中进行扩增和表达。,基因工程总体策略（2）,重组蛋白的生产 品种、菌株改良 遗传基因分析,2. 目标基因的克隆与鉴定,蓝-白选择,活性筛选,放射自显影或生色反应,用32P标记探针,迪高莘标记探针及Marker,3. 宿主和载体,克隆载体 是一个能复制的 DNA分子，被用来运载插入的外源基因进

30、入受体细胞。它可以是质粒、噬菌体、粘粒或人工染色体。 - L M Prescott et al., in MICROBIOLOGY, 5th ed.,外源基因由克隆载体携带进入宿主细胞,Ori,AmpR,Foreign,gene,MCS,Vectors carry genes into host cells,质粒图谱范例,大肠杆菌K12及其衍生菌株,重组蛋白生产的优势: a. 可以对基因加以改造; b. 基因拷贝数大量提高; c. 用强启动子进行快速转录; d. 基因翻译得到优化; e. 可进行主动调节; f. 宿主细胞易于培养.,4. 重组蛋白的生产,a. 基因定位突变技术,GGGTTTCC

31、CGGGTTTAAA,CCCAAAGGGCCCAAATTT,CCCAAAGGGCCCAAATTT,GGGTTTCCCGGGTTTAAA,GGGTTT,AAATTT,YYY,XXX,GGGTTTCCCGGGTTTAAA,CCCAAAGGGCCCAAATTT,YYYYYY XXXXXX,YYYAAATTT CCCAAAYYY XXXTTTAAA GGGTTTXXX,Blunting Kination Ligation,PCR,极耐热性木聚糖酶基因的突变效果,DNA mRNA Protein,基因组 重组基因,转录,翻译,多拷贝 强转录 优化翻译,b. c. d. 蛋白质合成过程中的优势,E.col

32、i 中 lac 启动子 lac & trp 启动子的杂 合体 Ptac E. coli 噬菌体 T7启动 子 E. coli 的l噬菌体 启 动子PL phage,PHsh from E.coli,e. 主动调节 E. coli表达体系中的调控模式,PL启动子的表达调控,PL +1 RBS FG Terminator,30,40 ,mRNA,热激,热敏感性抑制子cI,T7启动子的表达调控,T7 Promoter,待表达基因,宿主细胞,宿主染色体,质粒,质粒,Plac,T7 RNA 聚合酶基因,f. 极端酶高效表达 极耐热性木聚糖酶基因的表达,四、生物种系的遗传改良 及疾病的基因治疗和基因药物

33、1. 基因重组微生物 2. 通过植物转基因改良品种 3. 动物的转基因 4. 基因治疗与基因药物,定义：代谢(途径)工程 is the use of molecular techniques (or recombinant DNA techniques) to improve the efficiency of pathways that synthesize specific products. - L M Prescott et al., in MICROBIOLOGY, 5th ed,1. 基因重组微生物,Zymomonas mobilis 的乙醇发酵途径,Entner-Doudorof

34、f pathway 丙酮酸 乙醛 + CO2 乙醇,乙醇脱氢酶,丙酮酸脱羧酶,E. coli 的部分代谢途径,EMP途径 乳酸 丙酮酸 甲酸 CO2+H2 乙酰辅酶A 磷酸转移酶 乙醛脱氢酶 乙酰磷酸 乙醛 乙酸激酶 乙醇脱氢酶 乙酸 乙醇,乳酸脱氢酶,E. coli 的代谢工程,EMP途径 乳酸 丙酮酸 乙醛 甲酸 CO2+H2 乙酰辅酶A 乙醇 磷酸转移酶 乙醛脱氢酶 乙酰磷酸 乙醛 乙酸激酶 乙醇脱氢酶 乙酸 乙醇,乳酸脱氢酶,丙酮酸脱羧酶,乙醇操纵子设计 宿主菌株的选择 基因的整合 表达水平的筛选 条件优化等,乙醇脱氢酶,外原基因构建途径,利用木质纤维水解液的乙醇发酵菌株 菌株 产量

35、得率 速率 （g/l） （%） （g/l /h） Sacharomyces 1400 21.0 98 1.60 Z. mobilis CP4 22.6 88 1.04 E. coli KO11 34.7 80 1.16,代谢工程菌发酵水平比较,2. 通过植物转基因改良品种 农杆菌属细菌生活在土壤中，从伤口侵入植物组织后，将T-DNA 插入植物的染色体，产生激素刺激细胞生长，并指导细胞合成细菌所需要的营养物质。 A. tumefaciens促使细胞过量生长产生大块细胞团，引起冠瘿病；A. rhizogenes侵染植物根部导致异常生长，形成“发根”。 这两个种是植物遗传工程的重要工具。,T-DNA

36、,整合,分泌,细胞分裂素 植物生长素,植物细胞,核孔,VirD2,分泌,冠瘿碱,伤害,分泌,乙酰丁香酮,农杆菌,细胞核,Pi-VirA,诱导vir表达,从Ti质粒中切出TDNA,VirD4,VirD2,VirB,农杆菌和植物的相互作用,用Ti质粒构建的穿梭载体,3. 动物的转基因,最有效方法： 用病毒转染动物或动物胚胎。 主要目的： 用动物表达产生人类特定的组织或器官； 建立人类疾病治疗的动物模型； 昆虫、猪、羊等都能被用来表达人类蛋白。,逆转录蛋白（retrovirus） 单链RNA，侵染哺乳动物； 侵染后，RNA逆转录产生双链DNA； 启动子很强，是基因治疗的理想载体。,杆状病毒（bacu

37、lovirus） 是双链DNA昆虫病毒，粒子杆状，可以被单独排出胞外，也能在细胞内被包装成多角体，即：许多杆状粒子被包埋在多角蛋白中。 多角蛋白的启动子特别强，可大量表达外源基 因； 昆虫体系能完善翻译后的修饰； 适用于生产动物蛋白。,4. 基因治疗与基因药物 有些疾病的发生是由于染色体中的某一个基因失常，彻底治愈这类疾病的方法是用正常基因来替代缺陷基因。将新基因导入人体，对缺陷基因进行改正或修复，从而对疾病进行治疗的方法称为基因治疗。 基因治疗中通常以逆转录病毒为载体，将新基因直接导入体内的增殖细胞。,反义RNA作为基因药物 有些疾病是由于某一种蛋白的不正常表达所引起，如大多数病毒病、癌症、

38、早老性痴呆等都是由于一些不应有的基因表达所导致的病症。解决这些问题的有效办法是防止相关基因的转录和表达。 反义RNA的碱基序列与mRNA上翻译起始区域附近的序列互补，与mRNA结合后能有效地阻止核糖体的结合和翻译的启动。,RNA干涉现象 这个现象最早发现于线虫中，其大致过程是：进入细胞的双链RNA在细胞质中被双链RNA酶切割成2123个碱基的短小干扰RNA (siRNA)；siRNA随之解旋，所产生的单链和其它的因子一起形成一种复合体，叫做RNA诱导的沉默复合体（RISC）；RISC通过siRNA识别具有互补序列的靶mRNA并将其切断。,siRNA作为基因药物 siRNA在使用效率和特异性方面

39、优于反义RNA。 siRNA的发展非常迅速，已经开始进入眼病、肝炎等疾病的临床应用。 2005年我国科学家宣布用siRNA抑制SARS病毒的试验取得成功。,主要参考书： 1. Madigan, MT, JM Martinko, and J Parker.2003. Brock Biology of Microbiology, 10th ed. Printice Hall, New Jersey. 2. Talaro, KP. 2005. Foundations in Microbiology, 5th ed. McGraw-Hill co. & High Education Press, Be

40、ijing. 3. Prescott, LM, JP Harley, and DA Klein. 2002. Microbiology, 5th ed. McGraw-Hill co. & High Education Press, Beijing. 4. Turner, PC, AG McLennan, AD Bates and MRH White. 1997. Instant Notes in Molecular Biolgy. Bios Scentific Publishers Limited, 2000. 5. Maloy, SR, JE Cronan Jr, and D Freifelder. 1994. Microbial Genetics, 2nd ed. Jones and Bartlett Publishers, Boston. 6. 陈三凤，刘德虎. 2003. 现代微生物遗传学. 化学工业出版社，北京. 7. 周德庆.2002. 微生物学教程. 高等教育出版社，北京.,