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1、微生物实验室,颜小平 自贡三院,1.生物安全防护实验室 在以微生物为实验（检测）对象的实验工作中，针对微生物危害程度建设的可以预防生物危害，保障工作人员自身和临近安全的实验室称为生物安全防护实验室。,生物安全防护三原则,实验室生物安全防护的内容包括： 安全设备、个体防护装置和措施（一级防护） 实验室的特殊设计和建设要求（二级防护） 严格的管理制度和标准化的操作程序和规程,术语和定义,2.1 生物因子 biological agents 一切微生物和生物活性物质 2.2 病原体 pathogens 可使人、动物或植物致病的生物因子。 2.3 危险废弃物 hazardous waste 有潜在生物
2、危险、可燃、易燃、腐蚀、有毒、放射和起破坏作用的对人、环境有害的一切废弃物。 2.4 危害 risk 伤害发生的概率及其严重性的综合。 2.5 气溶胶 aerosols 悬浮于气体介质中的粒径一般为0.001100的固态或液态微小粒子形成的相对稳定的分散体系。,2.6 生物安全 biosafety 避免危险生物因子造成实验室人员暴露、向实验室外扩散并导致危害的综合措施。 2.7 高效空气过滤器 high efficiency particulate air filter(HEPA) 通常以滤除大于等于0.3微粒为目的，滤除效率符合相关要求的过滤器。 2.8安全罩 safety hood 置于实
3、验室工作台或仪器设备上的负压排风罩，以减少实验室工作者的暴露危险。 2.9生物安全柜 biological safety cabinet(BSC) 负压过滤排风柜。防止操作者和环境暴露于实验过程中产生的生物气溶胶。 2.10个人防护装备 personal protective equipment(PPE) 用于防止人员受到化学和生物等有害因子伤害的器材和用品。,2.11 实验室分区 laboratory area 按照生物因子污染概率的大小，实验室可进行合理的分区。 2.12 缓冲间 buffer room 设置在清洁区、半污染区和污染区相临两区之间的缓冲密闭室，具有通风系统，其两个门具有互锁
4、功能，且不能同时处于开启状态。 2.13 气锁 air lock 气压可调节的气密室，用于连接气压不同的两个相邻区域，其两个门具有互锁功能，不能同时处于开启状态。在实验室中用作特殊通道。,危害程度分级,根据生物因子对个体和群体的危害程度将其分为4级。 危害等级（低个体危害，低群体危害） 不会导致健康工作者和动物致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子。 危害等级（中等个体危害，有限群体危害） 能引起人或动物发病，但一般情况下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危害的病原体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限。,危害程度分级,危害等级（高个体危害，低群体危害
5、） 能引起人类或动物严重的疾病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生互不、抗寄生虫药治疗的病原体。 危害等级（高个体危害，高群体危害） 能引起人类或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接、间接或因偶然接触在人与人，或动物与人，或人与动物，或动物与动物间传播的病原体。,生物危害评估,当实验室活动涉及传染或潜在传染性生物因子时，应进行危害程度评估。危害程度评估应至少包括下列内容：生物因子的种类（已知的、未知的、基因修饰的或未知传染性的生物材料）、来源、传染性、致病性、传播途径、在环境中的稳定性、感染剂量、浓度、动物实验数据、预防和治疗。 危害程度评估应由适当的有
6、经验的专业人员进行。,防护屏障和生物安全水平分级,5.1 防护屏障 5.1.1 一级防护屏障 实验室的生物安全柜和个人防护装备等构成的防护屏障。 5.1.2 二级防护屏障 实验室的设施结构和通风系统等构成的防护屏障。 5.2 生物安全水平分级 根据所操作的生物因子的危害程度和采取的防护措施，将生物安全防护水平（biosafety level, BSL）分为4级，I级防护水平最低，级防护水平最高。以BSL1、BSL2、BSL3、BSL4表示实验室的相应生物安全防护水平；以ABSL1、ABSL2、ABSL3、ABSL4表示动物实验室的相应生物安全防护水平。,生物安全柜的分级,I 级生物安全柜 cl
7、ass I biosafety cabinet 至少装置一个高效空气过滤器对排气进行净化，工作时柜正面玻璃推拉窗打开一半，上部为观察,下部为操作窗口.外部空气由操作窗口吸进,而不可能由操作窗口逸出.工作状态时保证工作人员不受侵害，但不保证实验对象不受污染。 级生物安全柜 至少装置一个高效空气过滤器对排气进行净化，工作空间为经高效过滤器净化的无涡流的单向流空气.工作时正面玻璃推拉窗打开一半，上部为观察窗，下部为操作窗口.外部空气由操作窗口吸进,而不可能由操作窗口逸出。工作状态下遵守操作规程时既保证工作人员不受侵害，也保证实验对象不受污染。 级生物安全柜 至少装置一个高效空气过滤器对排气进行净化，
8、工作空间为经高效过滤器净化的无涡流的单向流空气。正面上部为观察窗，下部为手套箱式操作口。箱内对外界保持负压.可确保人体与柜内物品完全隔绝。,生物安全实验室分级,1 没有特殊要求, 不需要特殊培训。进行一级生物安全实验。 2 工作人员需要经过培训，配备生物安全柜（1级或2级），有可能发生气溶胶或溢出的实验要求在安全柜内进行。进行二级生物安全实验。 3 工作人员必须经过特殊培训, 配备生物安全柜（1级或2级）, 有感染性材 料的实验, 有可能发生气溶胶或溢出的实验要求在安全柜内进行，实验室内为负压, 进行三级生物安全的实验。 4 除BSL-3的条件外, 必须是独立的建筑物，生物安全柜为2或3级，进
9、行四级生物安全的实验。,实验室标记举例 三级生物安全实验室 BSL-3 病原体名称 实验室负责人 生物危害标记,实验室和微生物的分级,一级生物安全防护实验室 实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对健康成年人已知无致病作用的微生物，如用于教学的普通微生物实验室等。包含微生物举例： 大肠杆菌、格鲁伯耐格里原虫、感染性犬肝炎病毒、枯草杆菌等。,实验室和微生物的分级,二级生物安全防护实验室 实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物。包含微生物举例：麻疹病毒、 沙门氏菌 、弓形体、乙型肝炎病毒、衣原体、志贺氏菌。 三级生物安全防护实验室 实验室结构和设施
10、、安全操作规程、安全设备适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有预防传染的疫苗和相应的治疗方法。,实验室和微生物的分级,艾滋病病毒的研究（血清学实验除外）应在三级生物安全防护实验室中进行。包含微生物举例：结核分枝杆菌 、牛分枝杆菌、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、热病原体、HIV (血清学检测除外)、澳大利亚立克次氏体、加拿大立克次氏体 。,实验室和微生物的分级,四级生物安全防护实验室 实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人体具有高度危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。与上述情况类似的不明微生物，
11、也必须在四级生物安全防护实验室中进行。待有充分数据后再决定此种微生物或毒素应在四级还是在较低级别进行。,实验室和微生物的分级,实验脊椎动物生物安全防护实验室，其适用微生物范围与同级的一般生物安全防护实验室相同。以ABSL-1、 ABSL-2、 ABSL-3、ABSL-4表示动物实验室的相应生物安全防护水平。,生物安全防护实验室基本要求 （设施和设备）,一级生物安全防护实验室 BSL-1,6.1 1）无需特殊选址，普通建筑物即可，但应有防止节肢动物和啮齿动物进入的设计。 2）每个实验室应设洗手池，宜设置在靠近出口处。 3）在实验室门口处应设挂衣装置，个人便装与实验室工作服分开放置。 4）实验室围
12、护结构内表面应易于清洁。地面应防滑、无缝隙，不得铺设地毯。,5）实验台表面应不透水，耐腐蚀、耐热。 6）实验室中的家具应牢固。为易于清洁，各种家具和设备之间应保持一定间隙。应有专门放置生物废弃物容器的台（架）。 7）实验室如有可开启的窗户，应设置纱窗。 8）实验室内应保证工作照明，避免不必要的反光和强光。 9）应有适当的消毒设备。,二级生物安全防护实验室 BSL-2,6.2 1）满足6.1的要求 2）实验室门宜带锁、可自动关闭。实验室的门应有可视窗。 3）应有足够的储存空间摆放物品以便使用。在实验室工作区域外还应当有供长期使用的储存空间。 4）在实验室内应使用专门的工作服；戴乳胶手套。 5）在
13、实验室的工作区域外应有存放个人衣物的条件。,6）在实验室所在的建筑内应配备高压蒸汽灭菌器，并按期检查和验证，以保证符合要求。 7）应在实验室内配备生物安全柜。 8）应设置洗眼装置。必要时应有应急喷淋装置。 9）应通风，如使用窗户自然通风，应有防虫纱窗。 10）有可靠的电力供应和应急照明。必要时，重要设备如培养箱、生物安全柜、冰箱等应设备用电源。 11）实验室出口应有在黑暗中可辨认的标识。,总结,生物安全防护实验室：用于检测具有生物危害的标本和材料，通过合理实验室建筑结构和布局，使用一定的防护设备。主要保障工作人员自身不受侵害和周围环境的安全，同时也保证受检标本原有性状。,如何建立一个微生物实验
14、室呢？,电热恒温培养箱 电热鼓风干燥箱 高压蒸汽灭菌锅 电冰箱 电子天平 生物显微镜 净化工作台或生物安全柜 纯水蒸馏水器 电热恒温水箱 红外接种环灭菌器 离心机 细菌鉴定分析系统,微生物实验室设备配置表,普通光学显微镜 暗视野显微镜 荧光显微镜 倒置显微镜 电子显微镜,显微镜,一.形态学检查 1.不染色标本的检查：标本中的有形成分观察、细菌动力观察（湿片法、悬滴法、毛细管法）,临床细菌检验技术与方法,革兰染色（自动染色机） 抗酸染色： 萋-尼染色法（加热） 金永染色法（不需加热） 改良金永染色（1%硫酸脱色3分钟） 墨汁荚膜染色法：新型隐球菌 瑞氏染色：细菌染成蓝色 乳酚棉兰染色,2.染色标
15、本的检查,无菌操作技术 基本要求与无菌技术,临床细菌分离培养,接种环及接种针 设施和设备：为达到无菌技术要求而建立的细菌接种场所。 接种和分离方法： 平板划线分离法： 连续划线分离法（含菌量少的标本） 分区划线分离法（含菌量多的标本） 棋盘划线分离法（含菌量多的如：大便标本）,接种基本条件,斜面接种法 穿刺接种法 液体接种法 倾注平板法 涂布法 自动接种法,接种分离方法,血平板 巧克力平板 麦康凯或中国蓝平板 沙保弱琼脂平板或真菌显色平板 SS平板,培养基的选择,需氧培养法：又称普通培养法 二氧化碳培养法（肺链、脑膜炎奈瑟、嗜血杆菌属等） 微需氧培养法（5%氧气、10%二氧化碳、85%氮气的气
16、体环境） 厌氧培养法,培养的方法和条件,通过分纯获得待鉴定细菌的纯培养物 形态与染色：革兰染色分为四类 根据染色性和菌体形态选择鉴定系统；手工法或商品化鉴定系统等,细菌鉴定,国外：手工鉴定系统API、Micro-ID、BD等 国内：珠海DL等,商品手工鉴定系统,双相血培养瓶,商品化人工血培养系统,自动化血培养系统,全自动微生物鉴定和药敏分析系统,结核分枝杆菌快速检测系统,教科书 其它工具书,推荐的书籍,要想当一名合格的临床微生物学人 坚实的基础 执着的精神 耐的了寂寞 把每一个细菌都当成是恋人，了解它到细微处！ “与临床密切沟通联系，因为我们共同面对的是另一类地球生物-微生物”,个人感想：,Thanks！,