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1、农药的代谢,代谢研究方法,活体研究in vivo 离体研究 in vitro,组织匀浆,沉淀（细胞核、组织碎片） 滤液,上清液 沉淀（叶绿体）,上清液 沉淀（线粒体）,上清液（胞液、核糖体 ） 沉淀（微粒体）,100,000105,000g, 1hr,9,00011,000g, 30min,1,0003,000g, 10min,过滤,代谢酶,初级代谢酶 水解酶、多功能氧化酶（MFO） 次级代谢酶 谷光甘肽-s-转移酶（ GST ）、葡萄糖醛酸转移酶（glucuronyl transferase）、硫酸转移酶（sulphate esterase）、甘氨酸转移酶、葡萄糖转移酶,多功能氧化酶（MFO
2、）,RH O2 2H ROH H2O,MFO是膜结合酶。主要由P450、NADPH-细胞色素还原酶、NADH-细胞色素b5还原酶、磷脂等成份构成。 其中细胞色素P450的还原形式与CO结合后在450 nm附近产生特征吸收峰，故命名为P450。 细胞色素P450几乎在所有的生物中都存在，包括动物、植物、昆虫、细菌等。,反应机理,P450本质上属于血红素硫铁蛋白（heme-thiolate protein），上面有底物和氧的结合位点。 NADPH-细胞色素还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶在酶系中起电子传递作用。,This entire reaction cycle usually takes
3、between 1 and 10 seconds,P450的多样性,根据分类命名系统, P450蛋白或基因全序列同源部分40%为同一家族（family）, 用一阿拉伯数字表示； 同源性40%65%为同一亚族（subfamily）界限，在家族表达式后加一大写英文字母； 每一亚族内的单个酶则在表达式后再加一阿拉伯数字,哺乳动物,目前已知哺乳动物体内有14 个CYP450 家族, 即CYP1、2、3、4、5、7、8、11、19、21、24、27、51 （夏 伟 ，2000）。 其中CYP1 CYP4 家族是代谢外来化合物的主要酶系, 并且各同工酶有其较固定的代谢底物、反应类型。 CYP1A 的底物以
4、环境致癌物为主, 如多环芳烃、黄曲霉毒素。 CYP2E1 则主要参与乙醇等小分子化合物的代谢, 特别是亚硝胺在体内产生致癌、诱变产物必须经CYP2E1 的A2羟化作用。 大多数临床口服药物在体内的代谢酶是CYP3A。,植物,植物的第一个P450cDNA 是CYP71A1 ,它是由Bozak等（1990 ）由鳄梨中分离出的与成熟有关的P450基因。 至今已鉴定了90多个植物P450 基因。它们分属于27 个家族（CYP51, CYP71, CYP72 CYP96)（刘 宛等，2001）,昆虫,昆虫的第一个P450cDNA是Snyder和Davidson （1983）从果蝇Drosophila m
5、danogaster中分离的，但当时并不知道它是细胞色素P450基因，后来被重新发现而被定名为CYP4E1。 昆虫的P450基因总数尚不清楚，至今已鉴定的昆虫P450基因已超过50个，分属6个基因家族(CYP4，CYP6，CYP9，CYP12，CYP28，CYP18)。其中CYP4，CYP6，CYP9，CYPI2，CYP28等5个基因家族为昆虫所特有（潘贻武等，2007） 。,P450的可诱导性,P450可以代谢许多亲脂化合物，包括胆固醇、类固醇、激素、维生素D等内源化合物和外源非极性化合物。 天然化合物 除虫菊素pyrethrins、单萜类monoterpene、黄酮类flavonoid、香
6、豆素coumarins、甾醇、异黄脑素、2十三烷酮、2十三烷酮、吲哚3甲醇、尼古丁、胡萝卜素、己醇、保幼激素、蜕皮酮、等等。 人工化合物 苯巴比妥phenobarbital(BP)、3甲基胆蒽（3MC）、DDT、环戊二烯类杀虫剂、萘napthaiene、西维因、有机磷化合物（TOCP、TPP、DEF）、丁羟基丁氧化物butylhydroxy butoxide、丁羟基甲苯butylhydroxy toluene、烷基苯alkylbenzenes、polychlorinated bephenyls（PCBs）、增效醚piperonyl butoxide(PBO)、苯酰苯脲benzoylphenyl
7、ureas、保幼激素类似物、等等（邱星辉、冷欣夫，1997）,根据现有资料，细胞色素P450能够被大约200种化合物诱导，能够催化约40种类型的化学反应，现有底物约1,000种（邱星辉、冷欣夫，1997）。,MFO参与的代谢反应,烷基羟化,芳基羟化,O烷基羟基化,N烷基羟基化,环氧化,脱S（活化）,S加氧（活化）,MFO与抗药性的关系,家蝇CYP6A1能够将艾氏剂和氯丹分别氧化为狄氏剂和环氧化氯丹 。 重组杆状病毒感染的鳞翅目细胞系统中表达的CYP6A2除了能够将艾氏剂和氯丹氧化相应的环氧化物，还能通过脱硫作用和氧化酯解作用分别将有机磷杀虫剂二嗪磷diazinon代谢为diazoxon和2异丙
8、基4甲基6羟基嘧啶。 果蝇CYP4E2基因在DDT抗性品系中高效表达 CYP6D1mRNA的高效表达与家蝇对二氯苯醚菊酯的抗性有关 （朱礼华等，2000）,CYP4mRNA的高效表达与淡色库蚊对溴氰菊酯的抗性有关 （朱昌亮等，2001）,MFO的检测,P450含量测定 底物氧化法 mRNA含量测定,P450含量测定,特征光谱：还原性P450与CO结合后在450nm处有最大吸收峰 在加有适量连二亚硫酸钠的试管里，加入微粒体悬液，混匀，通CO气体1min，在分光光度计上400500 nm 范围进行扫描。计算公式为P450=(A450一A490)(91Pr)1 000(nmolmg蛋白)，其中91为
9、吸光系数，Pr为蛋白质浓度(mgmL) （严敏芬等，2006）,底物氧化法,7-乙氧基异吩恶唑 7-乙氧基异吩恶唑0-脱乙基酶（EROD） 7-乙氧基豆香素 7-乙氧基豆香素0-脱乙基酶（ECOD） 苯并芘BaP 芳基羟化酶(AHH) 艾氏剂 环氧化酶,芳香基羟基化酶（aryl hydroxylase，AHH）,刘永杰 等 （ 2005）以苯并芘为底物得抗氯氟氰菊酯的甜菜夜蛾品系中肠微粒体AHH比敏感品系高1.51倍,O-烷基羟基化酶,用对硝基苯甲醚，又称对硝基茴香醚（p-nitroanisole, PNA）为底物。反应生成的对硝基酚在碱性条件下呈黄色，在400nm波长下比色：,N-烷基羟基化
10、酶,以对氯-N-甲基苯胺为底物，每5毫升的反应体系中加入3mol。用含6%对二甲基氨基苯甲醛的3mol/L硫酸溶液中止反应，在387纳米波长下比色：,环氧化酶,用艾氏剂作底物，由气相色谱法检测（刘永杰 等，2005）。,测定MFO较为灵敏的方法，是以7-乙氧基异吩恶唑或7-乙氧基豆香素作底物，以荧光法测定酶的脱O-烷基（EROD，ECOD）活性。 测定EROD活性的反应体系中，7-乙氧基异吩恶唑的添加量只需要1mol/L, 用对硝基苯甲醚和对氯-N-甲基苯胺作底物时，底物添加量分别需达到800mol/L和600mol/L。 以荧光法测定EROD活性时，取激发波长537纳米，发射波长为583纳米
11、。,EROD,酶源和辅基,MFO的催化反应需要还原型辅酶II（NADPH）的参与 可直接使用NADPH，也可以用NADP、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成的NADPH生成系统作辅酶。 检测MFO的催化反应多以微粒体作为酶源,ethoxyresorufin,methoxyresorufin,pentoxyresorufin,酯酶,羧酸酯酶（B-酯酶 ，EC 3.1.1.1 ）马拉硫磷,芳基二烷基磷酸酯酶（A-酯酶 ，EC 3.1.8.1 ，对氧磷酶 ）,酯酶在害虫有机磷的抗性中起着极为重要的作用，在对氨基甲酸酯和拟除虫菊酯的抗性中也起一定作用。 酯酶在抗性机制中具有两个作用 通过水解
12、作用产生无毒代谢产物 结合作用杀虫剂，形成磷酰化酶或氨基甲酰化酶，使杀虫剂不能到达靶标。 两者均能起到保护体内靶标乙酰胆碱酯酶免受抑制。,酯酶与抗药性,酯酶参与的代谢反应,酰胺（水解）酶乐果,芳基酰胺（水解）酶敌稗,环杨化物水解酶西维因,酯酶的检测,酯酶可水解-醋酸萘酯为醋酸和-萘酚。后者与固蓝B盐反应生成一个蓝紫色物质（=550600纳米nm）。 酯酶的检测也可以用-醋酸萘酯作底物，产物呈紫红色。 pH对显色反应有很大影响。 染液中可加入45%的SDS，一来增色，二来终止反应。,-和-醋酸萘酯为非特异性底物，检测昆虫酯酶时，可在反应体系中加入10-7 mol/L左右的毒扁豆碱，以消除胆碱酯酶
13、的活性 。 毒扁豆碱不能排除其它酯酶，如A-酯酶的活性。 所幸A-酯酶一般只存在于哺乳动物体内。,谷光甘肽-s-转移酶（ GST ）,根据底物的不同， GST （EC 2.5.1.18 ）又可以分为谷胱甘肽-S-烷基转移酶、谷胱甘肽-S-芳基转移酶和谷胱甘肽-S-环氧化物基转移酶。 以还原型glutathione（甘氨酸胱氨酸谷氨酸）作为辅酶 无论哺乳动物动物，还是昆虫体内的GST，多以二聚体形式存在。根据等电点的不同，可以分为碱性（）、中性（）、酸性（）三种类型,GST参与的代谢反应,西维因carbaryl,阿特拉津atrazine,GST参与的代谢反应,二嗪农diazinon,对氧磷par
14、aoxon,GST的检测谷胱甘肽-S-烷基转移酶,以14C标记的碘甲烷为底物，在酶的催化下，碘甲烷与谷胱甘肽生成不挥发的衍生物，未反应的碘甲烷以溴甲醇除去，通过对标记物的测定求出酶活性：,GST的检测谷胱甘肽-S-芳基转移酶,以1，2-二氯-4-硝基苯（DCNB）或1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）为底物 DCNB或CDNB与还原型谷胱甘肽产生轭合物，在360纳米波长下有最大吸收峰 据Fournier（1995）等的报道，家蝇体内的谷胱甘肽-S-转移酶可分为两种：酶活性的最适pH为酸性（6.5）的种类对1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）活性高，最适pH为碱性（8.0）的种类对1，2-氯-4
15、-硝基苯有较高活性(DCNB)。,葡萄糖醛酸转移酶（glucuronyl transferase）,主要存在于哺乳动物体内。 辅酶：尿嘧啶核糖焦磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）,葡萄糖醛酸转移酶参与的代谢反应1,西维因carbaryl,葡萄糖醛酸转移酶参与的代谢反应2,福美铁ferbm,硫酸转移酶（sulphate transferase, sulfotransferase ）,存在于哺乳类、两栖类、无脊椎动物体内 辅酶：3-磷酸腺嘌呤 5-磷硫酸酯（PAPS）,3-磷酸腺嘌呤 5-磷硫酸酯（3-phosphoadenosyl 5-phosphosulphate, PAPS）,硫酸转移酶参与的代谢反应,甘氨酸转移酶,存在于植物体内 以甘氨酸作为辅酶 反应类型：,麦草畏dicamba,葡萄糖转移酶,存在于植物体内 以葡萄糖作为辅酶,葡萄糖转移酶参与的代谢反应,氯黄隆chlorsulfuron,氯黄隆在小麦、大麦中降解快，而在大豆、甜菜等敏感作物中降解慢。,葡萄糖转移酶参与的代谢反应,氯苯甲醚chloroneb,