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1、第十三章 毛细管电泳 ( Capillary Electrophoresis, CE ),第一节 概述 早在一百多年以前,较原始的电泳实验,是在一个U形一管中进行的,管中盛有溶液,两端置有电极,加上几百伏电压后,首次实验了对毒素和抗毒素的分离。1909年,L.Michaelis提出“电泳”这一术语,他的实验是用于测定蛋白质的等电点。,此后,许多的研究报告涉及氨基酸、肽类、蛋白质的分离。为了防止电泳完成了的溶液中,再次发生对流混合,曾使用了各种稳定介质,如琼脂、纤维粉、玻璃丝、硅胶及丙烯酸胺; 为了防止热扩散而使用了一种内径小的管道,管道内径由3mm缩小至75m。1981年,Jorgenson和
2、Lukacs 使用75m内径的熔融石英毛细管,电泳分离氨基酸和肽。至此,出现了毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)技术。,毛细管电泳,又称高效毛细管电泳 (High Performance capillary electrophoresis,HPCE), 它不同于经典的区带电泳,有如下特点:,(1)它是在内径(10200)m的石英毛细管中进行的,在毛细管中的散热较好,沿着管截面的温度梯度很小,因此,可以提高加在毛细管两端的电压,所加电压可高达几十千伏。 (2)它不需要阻流介质,但可使用凝胶作分子筛介质。,(3)可使用在柱检测法,缩短分析时间,结合计算机处理数据
3、,可实现自动化操作。 (4)灵敏度高,检测限可达(10-1310-15)mol,使用激光诱导的荧光检测限可达(10-1910-21)mol。 (5)分辨率高,理论塔板数为几十万至几百万米。 (6)取样量少,有时只需几个纳升(nL,10-9L),流动相只需几毫升。,第二节 高效毛细管电泳的基本原理,溶质在毛细管区带电泳过程中的传递 含离子的溶液,在电场中所发生的物理过程服从欧姆定律,当有直流电通过溶液时,阴离子向阳极迁极,阳离子向阴极迁移,溶液的导电率取决于离于浓度和其迁移率(又称淌度,即指溶质在单位时间和单位电场强度下移动的距离)。离子迁移率以表示,其大小受溶质的电荷离子大小比例所控制。,在电
4、场的影响下,带电荷的质点受到的力Fe,等于其净电荷q与电场强度E的乘积,即Fe = qE。电场强度E以每单位长度所加的电压U来表示,即E=U/L,其中L是毛细管长度。Fe对正电荷为正值,对负电行为负值。 电场力促使带电质点向两极移动,质点在移动过程中,也受到一种与电场力方向相反的阻滞力Fd,阻止其移动,此阻滞力与质点的电泳速度成正比,由下式结出,Fd =f 式中,f是质点平移动所受的摩擦阻力,对小的球状物质点,可用斯托克斯(Stokes)定律表示,即: f=6r 式中,是溶液的粘度,r是离子半径。即摩擦阻力正比于溶液的粘度、质点大小和其电泳速度。由于存在摩擦阻力,一种带电质点在电场中运动,被加
5、速到一有限速度,此速度取决于Fe和Fd,这一有限速度称为电泳速度,ep 。当促进力与阻滞力达到平衡时,则,ep qEf 将上述表达式合并,作为电泳迁移率(或电泳 淌度)ep 。表示式,则 epepEq士6r 电泳迁移率定义为:一种质点在每单位电场强 度下的稳态速度。,ep 值的大小,取决于分子的净电荷数及其摩擦性质,(分子大小和形状)以及所用介质的介电常数和粘度。因而,对于每一种质点,在电场作用下的迁移均具有特定的速度。 对于大分子或胶体,其关系可表示为,HPCE分离,几乎都是在熔融石英毛细管中完成的,熔融石英是一种高度交联的SiO2聚合物,具有很好的抗拉强度。石英毛细管表面含有许多硅酸基(S
6、iOH),在一定的条件下可离解。使表面带有负电荷。 由于表面带负电,因此,带负电荷的离子被表面排斥,而带正电均离子则被毛细管壁吸引。,在毛细管壁的阴离子,与来自主体溶液中的阳离子在石英一溶液界面上形成双电层。由于静电场的作用,靠近表面的那些抗衡离子是不迁移的,因此构成所谓稠密层。 由于热运动关系,离表面远的离子构成可迁移层或扩散层,因为在双电层内离子的立体分布,就形成一种电势梯度.,当在毛细管两端加有电场时;扩散层内可迁移的阳离子向阴极移动。由于离子是被水化的,因此,在缓冲液中的液体也随迁移着的阳离子一道,向阴极移动,形成一种液流,称之为电渗流(electroosmotic flow,EOF)
7、,它是一种电泳驱动力。在双电层内,EOF总是向双电层内抗衡离子方向迁移,穿过双电层的电势下降的程度受电渗流速度所控制。电渗流的线速度eo ,可以定义为:,Zeta电势可表示为: =4/ 式中,是毛细管表面电荷密度;为双电层厚度。按近代电解质理论,等于1K,因此式可写为:,第三节 在CZE分离中的迁移时间、效率及分辨率,在电渗流存在下,离子的迁移速度可表示为: =(eo)U/Lt 式中,Ld是毛细管总长度;U是外加电压。离子的迁移时间为t,则 t=LtLd/(eo)U 式中,Lt为进样端到检测器之间的毛细管长度,或称为迁移长度。分离效率n可表示为,式中,D为溶质的平均扩散系数。由上式可见,如果热
8、影响阿忽略不计的话,增大电压,可增加分离效 率。,按Gidding方程5,分辨率R只可定义为,1和2两溶质的电泳迁移率,而是它们的平均电泳迁移率。,在许多情况下,电渗流速度比许多质点的电泳速度要快,因此,在毛细管中的所有溶质将朝一个方向迁移,不管它们带多少正电荷,都将先被检出,继之中性质点被检出,最后带负电荷的质点被检出。如下图所示。,第四节 HPCE仪器的基本结构,HPCE仪器的基本结构如下页图所示。充满缓冲液的毛细管,两端分别浸入盛有缓冲液的储瓶中,之后通以30kV的电压,整个带电管路置于一个安全保护盒内以防高压危险,打开有机玻璃盒时即自动切断电源。 待测组分从毛细管的一端引人,在电场作用下,由于离子迁移速度有差别,而在整个毛细管内形成不同的样品区带,在毛细管的另一端放置检测器,以便连续地检测流过的每一个组分带,分析信号通过检测器接收后。经放大再输入计算机系统进行数据处理与储存。,