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1、第十五章 生物技术与作物育种,第一节 细胞工程与作物育种 植物细胞工程：是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来的一门科学。 它以细胞为单位，在体外（in vitro）条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿生产某种物质过程。包括花药培养、体细胞变异筛选、幼胚培养、试管受精和原生质体融合等,理论基础： 细胞的全能性（cell totipotency）。指细胞所具有的形成各种细胞类型的潜在能力。 因为细胞核内有保持物种遗传性所需要的全套遗传物质所以高度分化的体细胞具有发育成一个生物体的能力。,一、植物细胞和组织培养技术 （一）培养基及其组成 1、培养基的种类和特点 （1）MS
2、培养基 （2）B5培养基 （3）White培养基 （4）N6培养基 （5）KM-8p培养基 （6）SH培养基,2、培养基的成分,3、培养基的配置 (1)水和药品 水必须采用蒸馏水或无离子水，药品最好采用分析纯，至少是化学纯药品。 (2)母液的配置 为方便培养基的制备，现将培养基的各种成份分类配成浓缩的母液，正式配制时按规定用量稀释混合。 (3)制备培养基 混合各成分母液 熔化琼脂 (4)培养基的消毒 主要有高温高压灭菌和过滤灭菌两种方法。,调pH值,分装,灭菌,放置备用,搅拌混匀,4、无菌操作方法 （1）消毒剂,消毒剂 使用浓度（%） 消除难易 消毒时间（min） 消毒效果 次氯酸钠 2 易
3、530 很好 次氯酸钙 910 易 530 很好 过氧化氢 1012 最易 515 好 溴水 12 易 210 很好 硝酸银 1 较难 530 好 氯化汞 0.11 较难 210 最好 抗生素 450mg/L 中 3060 较好,（2）无菌操作 （3）无菌培养 二、细胞和组织培养与作物育种 （一）体细胞克隆变异及其育种利用 1、体细胞克隆变异的遗传基础 （1）染色体数目变异 （2）染色体结构变异 （3）点突变 2、突变体的筛选,3、在作物改良上应用 （1）抗病 （2）抗除草剂 （3）抗氨基酸或氨基酸类似物 （4）耐盐 （5）耐旱,优良品种,细胞培养,R0,R0群体,改良体细胞克隆,确定遗传方式
4、,遗传稳定性测试,田间试验,育种新品系,多点田间试验,区域试验,继续田间试验、种子富集,审定,投入生产,利用体细胞克隆变异技术路线,（二）单倍体细胞培养及育种利用 1、单倍体细胞培养在遗传和育种中的应用价值 （1）后代的快速纯合 （2）提高选择效率 （3）排除杂种优势对后代选择干扰 （4）遗传研究的良好实验材料体系 （5）突变体的筛选,母本 X 父本,F1,F2,品系比较实验,区域试验,花药培养,花药培养,加倍,选择鉴定,杂交育种与单倍体育种周期比较,2、离体培养条件下的小孢子发育 （1）营养细胞发育途径 （2）生殖细胞发育途径 （3）营养细胞和生殖细胞并进发育途径 （4）花粉均等发育途径 3
5、、影响花药培养的因素 （1）供体植株的生长条件 （2）供体植株的年龄 （3）花粉发育时期 （4）花蕾和花药处理 （5）培养基 （6）培养条件,4、单倍体细胞培养与植物育种,A品种,X,B品种,F1杂种,单倍体培养,重组纯合体,重组了A和B品种优点的纯系,遗传稳定性测试,新品系,品种,亲本,推广利用,杂种优势利用,田间测试,自交，田间测试,确定遗传基础,杂交和分离测试,选择,染色体加倍,小孢子培养或花药培养,三、植物原生质体培养和体细胞杂交,植物原生质体：指用特殊方法脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。,（一）原生质体的分离 原则：保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力，先决条件要有一个
6、合适渗透压。 1、分离方法 （1）机械法 （2）酶法,2、影响原生质体分离因素 （1）材料来源 （2）渗透压 （3）酶 （4）分离培养基 （5）培养条件 （6）组织前处理 3、原生质体的收集、纯化和活力测定,（二）原生质体培养 （三）细胞融合（体细胞杂交） 1、融合方法 （1）NaNO3处理诱发融合 （2）高pH-高浓度钙离子处理 （3）PEG处理 （4）电融合 2、融合方式,3、杂种细胞筛选 （1）形态互补 （2）遗传互补 （3）代谢互补 （4）生长互补 4、杂种鉴定 5、细胞融合与作物育种,第二节 转基因技术与作物育种,作物转基因育种：根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经DNA重组与
7、遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，在经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。,常规育种技术相比，转基因育种具有很大优势： 1.可以利用的基因资源大大拓宽。 2.为培育优良品种提供了崭新的育种途径。 3.可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择。 4.可以大大提高选择效率，加速育种进程。,（一）作物的转基因技术 1、转基因技术的发展现状 （1）国际转基因植物研究与现状,全球转基因作物种植面积比较 （单位：万公顷）,（2）我国转基因作物研究与利用概况,转Bt基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现,（二）转基因育种程序,目的基因或DNA的获取,含有目的基因或者DNA
8、的重组质粒的构建,受体材料的选择和再生系统的建立,转基因方法的确定和外源基因的转化,转化体的筛选和鉴定,转基因植株的育种利用,1、目的基因的获得 （1）根据基因表达的产物-蛋白进行基因克隆 分离和纯化控制目的性状的蛋白质或多态，进行氨基酸序列分析; 根据所的氨基酸序列推导相应的核苷酸序列; 采用化学合成的方法合成该基因; 通过相应的功能鉴定来确定所推导的序列是否为目的基因。,（2）从基因组DNA或mRNA序列克隆基因 A、同源序列法和表达序列标签法 同源序列法是根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点发展的一条快捷克隆即因家族未知成员的新途径，即基于同源序列的候选基因法。
9、表达序列标签是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包含了该基因足够的信息区，因而可以和其他基因相区分。目前，表达序列标签主要是通过cDNA的途径获得。,B、根据连锁图谱克隆的基因,精确定位的大片段 DNA文库,连锁的分子标记筛选,含目的基因的大片 段DNA克隆,含目的基因的精细 物理图,染色体步行,分段制成探针,cDNA文库,目的基因,亚克隆文库,含目的基因 的亚克隆,序列分析及 基因克隆,目的基因的图位克隆方法示意图,C、转座子标签法,纯合体突变株,核基因库1,带转座子DNA片断,野生型植株,核基因库2,完整的目的基因,互补测验 检测功能,转座子探针,亚克隆片断做探针,转座子标签法克隆重
10、要农艺性状基因示意图,D、差异显示法 在生物个体发育的不同阶段或是在不同的组织、空间进行有序表达的方式，叫做基因的差异表达。 差异显示PCR是指通过对来源特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、电泳，并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带，该条代就有可能是全长或是部分特异表达的基因，利用这种方法进行基因克隆的方式就是差异显示法基因克隆。 现在又出现了限制性消减杂交（SSH）和RNA任意引物PCR（RAD-PCR）等多种方法。,2、目的基因重组质粒的构建 质粒重组的基本步骤： 从原核生物中获取目的基因的载体并进行改造； 利用限制性内切核酸酶将载体切开，并用连接酶把目的基因连接到载体上，获得DNA
11、重组体。,3、受体材料的选择 （1）良好的植物基因转化系统应具有的条件： 高校稳定的再生能力； 受体材料要有较高的遗传能力； 具有稳定的外植体来源； 对筛选剂敏感。 （2）常用受体材料的类型： 愈伤组织再生系统 直接分化再生系统 原生质体再生系统 胚状体再生系统 生殖细胞再生系统,4、转基因方法的确定和外源基因的转化 （1）.载体介导转移系统 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体携带将外源基因导入植物细胞并整合在核染色体组中随着核染色体组一起复制和表达。 主要方法有： 叶盘法 真空渗入法 原生质体共培养法,（2）.外源基因直接导入法 这是一种不需要借助载体介导，直接利用理化因素进行外援遗
12、传物质转移的方法。 主要方法有： 化学刺激法 基因枪轰击法(gene gun ) 高压电穿孔法(electroporation) 微注射法(microfibers ) 超声波介导法 脉冲电泳法 离子束介导法,5、转化体的筛选和鉴定 1.转化体的筛选 2.转化体的鉴定 （1）DNA水平的鉴定 （2）转录水平的鉴定 （3）翻译水平的鉴定,6、转化体的安全性评价和育种利用,二、转基因作物的遗传特点,（一）、外源基因整合机制 1、同源重组整合（homologous recombination） 外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生交换替代，并整合到受体染色体组上。 2、位点特异性重组（
13、site-specific recombination） 在两条DNA的特异位点上，通过位点特异性重组酶的作用对DNA进行特异性切割，实现外源基因的整合。,3、转座作用（transposition） 通过体外重组将外源基因插入到转座子系统中，当携带有目的DNA片段的重组转座成分复制并整合插入到染色体其他区域时实现外源基因的整合。 4、异常重组（illegimate recombination） 异常重组整合是外源基因整合到植物基因组的最常见方式。,（二）、整合后的外源基因在 植物体内的表现,共抑制：向受体植物种导入一个与受体内某基因同源的基因，导入的基因及受体内与它同源的基因表达都可能减弱的现
14、象。 基因沉默：转基因植株由于外源基因的结构被破坏或者外源基因插入了染色体异染色质区域，出现外源基因序列不表达。,(三)、外源基因在后代中的遗传规律,三、转基因作物品种的选育,（一）、转基因作物育种目标的制定,依据市场经济的需要和生产发展前景 依据不同的自然环境、栽培条件 落实具体性状目标 要考虑品种的搭配 要充分考虑转基因作物，尤其是外援目的基因对人类健康和环境安全的影响,（二）、转基因方法的确定及转基因植株的获得 （三）、转基因作物品种的选育 纯系育种 回交育种 杂交育种 杂种品种,（四）转基因作物的生物安全性,（1）转基因作物的环境安全性 转基因作物演变为农田杂草的可能性 基因漂流到近缘
15、野生种的可能性 对自然生物类的影响 （2）转基因作物的食品安全性(food safety) 有毒物质(potential toxicity ) 过敏源(allergenicity of newly introduced proteins) changes in concentrations of key nutrients or natural toxicants.,第三节、分子标记辅助选择育种,一、分子标记的类型和作用原理 1、分子标记的类型和特点 类型（按技术特性分类）,Hibridisation-based markers以分子杂交为基础的DNA标记技术（RFLP标记、DNA指纹技术、原
16、位杂交 ）,PCR-based markers以PCR反应为核心德DNA指纹技术 （RAPD标记、SSR标记、SSLP标记、SCAR标记 、AFLP标记、STS标记 ）,Sequencing based markers新型的分子标记（SNP标记、EST标记 ）,2、原理和遗传特性,(1)RFLP标记 A.RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的 碱基替换、插入、缺失 或重复等，造成某种限 制性内切酶酶切位点的 增加或丧失，从而产生 限制性片断长度多态 性。,基本步骤,DNA提取,用DNA限制性内切酶消化,凝胶电泳分离，转移到滤膜上,Southern杂交,放射性自显影或酶学检测,B、RFLP标记
17、的特点 （1）遍布于整个基因组， 数量 几乎是无限的； （2）无表型效应， 不受发育阶段器官特异性限制； （3）共显性， 可区分纯合子和 杂合子； （4）结果稳定、可靠； （5）DNA需要量大，检测技术繁杂， 难以用于大规模的育种实践中,（2）RAPD标记 A、 RAPD标记原理 B、 RAPD标记的特点 （3）AFLP标记 A、 AFLP标记原理 B、 AFLP标记的特点,（4）SSR标记 A、 SSR标记原理 根据微卫星DNA两端的单 拷贝序列设计一对特异引 物，利用PCR技术，扩增每个 位点的微卫星DNA序列，通过 电泳分析核心序列的长度多 态性。,基 本 步 骤,设计探针，筛选重组克隆
18、,根据SSR两侧序列设计并合成引物,PCR扩增反应,建立基因组DNA的质粒文库,对阳性克隆DNA插入序列测序,凝胶电泳检测多态性,B、SSR标记的特点 （1）SSR标记为共显性标记，可鉴别出纯合子和杂合子。 （2）重复性高，稳定可靠。 （3）DNA用量少，对DNA的质量要求也不太高。 （4）使用SSR技术需要知道重复序列两翼的DNA序列。,二、重要农艺性状基因连锁 标记的筛选技术,（一）、遗传图谱的构建与重要农业性状基因的标记 1、遗传作图的原理 其原理是基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合，而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期I非姊妹染色单体
19、间的交换而发生基因重组，用重组率来表示基因间的遗传距离。遗传图谱只显示基因间在染色体上的位置，并不反映DNA的实际长度。,2、构建遗传图谱的主要环节： 根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体。 对群体中不同植株的标记进行基因性分析。 借助计算机程序构建连锁群 3、构建遗传图谱，首先要选择合适的亲本及分离群体，而且亲本之间的差异不宜过大，否则会降低所建图谱的准确度和适用性。 4、用于分子标记的遗传作图可分为两类： 暂时性分离群体，包括F2群体、BC等 永久性分离群体，包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等,自花授粉作物作图群体的构建方法,P1P2,F1,F2,F3,F4,F1,B1:B
20、C1,F1P1,F1P1,F1P1,B2:BC2,DHL,异花授粉作物作图群体的构建方法,ABCDEfG,AbcdEfg,AbCDEfG,aBCdefg,杂合F1,对B、D、G位点来说，相当于F2 对A、C、E位点来说，相当于测交 F位点不分离,不同作物群体的特点,（二）、近等基因系的培育与重要农艺性状基因的标记 （三）、群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记 （四）、数量性状基因的定位,三、作物MAS育种,（一）、作物MAS育种须具备的条件 分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于5cM,最好1cM或更小。 具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，主要是应用PC
21、R技术。 筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、易操作的特点。 具有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。,供体,受体,RR Rr rr (1-P)2 2P(1-P) P2,M R,m r,M R,m r,目标基因与DNA标记间的遗传距离位p,亲本中DNA标记的带型,F1杂种中DNA标记的带型,在F2分离群体中分子标记类型 即MM,Mm,mm,MM类型的分子标记所代表的目标基因型及其频率,利 用 MAS 的 遗 传 基 础 （以 RFLP 为 例）,M抗性标记 R抗性基因 m感病标记 r感病基因,（二）、MAS育种方法,1、回交育种 2、SLS-MAS 3、MAS聚合育
22、种,受体亲本 供体亲本 (不含优质基因) (含优质基因),F1 受体亲本,BC1,目标基因定位,标记辅助选择,中选BC1 受体亲本 (含优质基因),BC2,BC3,标记辅助选择,标记辅助选择,中选BC3(含优质基因),新育成的优质品种 (受体亲本遗传本背景+优质基因),自 交,目标基因的定位 与标记辅助回交 育种相结合程序图,中选BC1 受体亲本 (含优质基因),受体亲本 供体亲本A (无优质基因) (含优质基因A),受体亲本 供体亲本B (无优质基因) (含优质基因B),F1(含优质基因A) F1(含优质基因B),复杂杂种(分离群体),受体亲本 供体亲本C (无优质基因) (含优质基因C),中选杂种个体 F1 (含优质基因A和B) (含优质基因C),复杂杂种(分离群体),中选杂种个体 受体亲本 (含优质基因A、B和C),新育成的优质品种 (受体亲本遗传背景+优质基因A、B和C),回交12代，标记辅助选择,自交,标记辅助选择,标记辅助选择,标 记 辅 助 基 因 聚 合,与 品 质 改 良 相 结 合 程 序 图,（三）、提高分子标记的筛选效率,1、多重PCR方法 2、用相斥相分子标记进行育种选择 3、克服连锁累赘 4、降低MAS育种的成本,