第十章微生物的遗传变异与育种第一节遗传物质的物质基础.ppt

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1、,第十章 微生物的遗传变异与育种 第一节 遗传物质的物质基础,遗传(heredity)： 亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。 特点：具稳定性。 遗传型（genotype）： 又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和 是一种内在可能性或潜力。,变异(variation): 生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变而导致表型改变。 变异的特点： a。群体一般为10-610-10； b.形状变化的幅度大； c. 变化后形成的新性状是稳定遗传的。,表型（phenotype）： 指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和; 是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现

2、出的具体性状。 遗传型 + 环境条件 表型 。,饰变（modification）： 指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。 特点： a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化； b.性状变化的幅度小； c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。,一、3 个经典实验,（一）经典转化实验 （二）噬菌体感染实验 （三）植物病毒重建实验,（一）经典转化实验,1928年 F.Griffith 肺炎链球菌 使小鼠患败血症死亡 S型菌株-菌株形成荚膜、菌落表面光滑、致病 R型菌株-菌株不形成荚膜、菌落表面粗糙、不致病,平板培养实验,热死S菌不生长

3、活 R 菌长出RII菌 热死S菌+活R菌长出大量R菌和10-菌,活R菌 + S菌无细胞抽提液 长出大量R菌和少量S菌,1944年 O.T.Avery,活R菌+ 加S菌DNA 加S菌DNA及DNA酶以外的酶 加S菌的DNA和DNA酶 加S菌的RNA 加S菌的蛋白质 加S菌的荚膜多糖,长出S菌,只长R菌,10分钟后 用捣碎器 使空壳脱离,吸附,离心,沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体,（二）噬菌体感染实验,含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,（三）植物病毒的重建实验,二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式,（一）核酸存在的七个水平及质粒 细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或

4、多核 细胞核水平: 原与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA 染色体水平: 倍性(真核)和染色体数 核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链 基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录翻译 密码子水平： 信息单位,起始和终止, 核苷酸水平： 突变或交换单位，四种碱基,DNA 的三种存在形式,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变,一、基因突变,突变：指生物体的表型发生的可遗传的变化。 狭义突变：基因突变点突变 广义突变：基因突变和染色体畸变 突变的几率：10-6 -10-9 野生菌株 -突变-突变株,（一）基因突变类型（表型分类）

5、,营养缺陷型（株） 抗性突变型（株） 条件致死突变（株）,形态突变型（株） 抗原突变型（株） 产量突变型（株）,营养缺陷型因突变而丧失合成某种物质的能力，因此必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。 抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性的突变株。,条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型 抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变,（二）突变率,每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。 突变率为108是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。 突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）

6、的数目来表示。 突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数,突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。,（三）基因突变的特点,以细菌的抗药性为例。 不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。 自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。 稀有性：突变率低且稳定。,（三）基因突变的特点,独立性：各种突变独立发生， 不会互相影响。 可诱发性：诱变剂可提高突变率。 稳定性：变异性状稳定可遗传 。,（三）基因突变的特点,可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变，从突变株回到野生型的过程则称为回复突变,（四）基因突变的自发性和不对应性,变量试验又称波动试验或彷徨试验

7、。 1943年，S. E. Luria 和M. Delbrck 根据统计学原理，设计了的实验。 大肠杆菌 大肠杆菌的T1噬菌体（烈性噬菌体） 观察统计抗噬菌体的抗性菌株数量,2、涂布实验,原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。,（五）基因突变剂机制,自发突变 诱发突变,1、 染色体数目的变化,n-2n-3n-4n 整倍变化 n-n+1、n-1， 2n-2n+1、2n-1、2n-2 非整倍变化 原核生物只有一条染色体，但可成为部分二倍体。,2、 染色体结构的变化,染色体结构的变化也称为染色体畸变，包括：缺失、重复、倒位、易位、转座。 一般认为这是由于染色体单体发生断裂后，错误性愈合而

8、造成的。 可造成隐性基因的表达、显形基因的拷贝数增多、某一性状的缺失、基因间连锁程度的变化、不同染色体基因的连锁等变化。,重复、缺失、倒位、易位,转座因子（可移动基因、跳跃基因）,插入序列 IS 转座子 Tn 转座噬菌体 Mn 转座频率：10-510-7 转座因子-复制-非同源重组 正向重复序列-转座酶基因-反向重复序列,3、基因突变（点突变）的诱变机制,诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂 种类：诱变剂的种类很多 代表性的诱变剂的作用机制。,（1）碱基置换（substitution）,一对碱基被另一对碱基所置换。 转换（transition），即DNA链中的一

9、个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换； 颠换（transversion），即一个嘌呤被一个嘧啶,或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换。,碱基的置换（实线代表转换；虚线代表颠换）,碱基置换后会出现下列几种情况,(1) 错义突变 一种氨基酸，变成另一种氨基酸； (2) 无义突变 氨基酸的碱基置换后变成 UAG（琥珀突变）、 UAA（赫石突变） UGA（乳石突变）等终止密码子；,配对原则,嘌呤 -嘧啶 6位上是氨基的嘌呤-4位上是酮基的嘧啶 6位上是酮基的嘌呤-4位上是氨基的嘧啶,* 烷化剂(alkylating agent),带有一个或多个活性烷基，诱变作用是其与DNA中的碱基或磷酸作用。 常

10、见的烷化剂有硫酸二乙酯（EDS）、甲基磺酸乙酯（EMS）、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（NTG）、亚硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。,B 间接引起置换的诱变剂,这类诱变剂主要是一些碱基类似物 这些化合物有5-溴尿嘧啶（5-BU），5-氟尿嘧啶(5-FU)、8-氮鸟嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤（2-AP）等。 它们与正常碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应，所以说它们引起碱基置换的作用是间接的。,（2）移码突变,移码突变是指由一种诱变剂引起DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的插入或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的

11、一类突变。,移码突变诱变剂,吖啶类染料（原黄素、吖啶黄、吖啶橙等） 和一系列称为ICR类的化合物（美国的肿瘤研究所合成而得名），都是移码突变的有效诱变剂,4、自发突变的机理,大多数自发突变本质上也是诱发的，只不过它不是人为的，而是自然环境或细胞内环境诱发的。 细胞外因素、 细胞内因素 DNA分子内部因素,（1）细胞外的诱发因素,自然环境或人工条件下的物理和化学因素 自然环境中，宇宙间的短波辐射、宇宙线和紫外线等，多因素低剂量长期辐射的综合效应，将会引起生物的自发突变。 自然环境中存在低剂量的金属离子、高分子化合物、生物碱药物、染料等都能成为引起生物突变的化学因素,（2）细胞内的诱发因素,细胞的

12、代谢活动会产生一些诱变物质，如过氧化氢、咖啡碱和重氮丝氨酸等，它们是引起自发突变的内源诱变剂。 许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能就是这类原因。,（3） DNA分子内部因素,DNA分子中的碱基存在着互变异构效应。 A、T、G、C四种碱基，存在酮基结构（T，G）或氨基结构（A，C）， 酮式与烯醇式存在互变异构， 氨基式与亚氨基式存在互变状态,（3） DNA分子内部因素,一般生理条件下，碱基互变平衡反应倾向于酮式或氨基式， DNA两条互补链之间总是以A:T和CG碱基配对。 但T偶尔也会以稀有的烯醇式形式出现，这样在DNA复制到达这一位置的瞬间，新合成链中T对应的不再是A，而是G；,（3

13、） DNA分子内部因素,同理，若碱基C以稀有的亚氨基形式出现，在DNA复制到达这一位置的瞬间，则它对应的不是G 据统计，碱基对发生自发突变的几率约为10 8 10 9。,环出效应,环状突出效应。有人提出，在DNA的复制过程中，如果其中某一单链上偶然产生一个小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失,（六）紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。 紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。,1、光复活作用（photoreactivation）,经紫外线照射后

14、的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。 对照：8106个/ml E.coli U.V. 100个/ml 试验：8106个/ml E.coli U.V. 360490nm 2106个/ml E.coli 可见光，30分,1、光复活作用（photoreactivation）,经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗下会被一种光激活酶即光裂合酶（photolyase）结合，当形成的复合物暴露在可见光（300500nm）下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。光激活酶也从复合物中释放出来。每一E.coli细胞中约含有25个光激活

15、酶分子。,1、光复活作用（photoreactivation）,由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及处理照射后的菌液。,2、暗修复作用（dark repair）,又称切除修复（excision repair）。是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂（包括烷化剂、X射线和射线等）损伤后的DNA的机制。这种修复作用与光无关。,有四种酶参与 内切核酸酶：切开 外切核酸酶：扩大 DNA聚合酶：复制 通过连接酶：连接 完成了修复作用。,3、紫外诱变方法:,设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等， 紫外灯：波长为253、7nm, 功率是15W 处理时的照射距离：20

16、cm 30cm 样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3mm 照射时，要用磁力搅拌器搅拌。 处理剂量：常用照射时间或死亡率作为相对剂量,在实际应用中，用死亡率表示照射剂量更可靠。 通常先绘制照射时间与死亡率的关系曲线，然后选择合适的剂量。 生产上经常采用的剂量： 死亡率为70%80%左右。,二、突变与育种,（一）自发突变与育种 1、生产中育种 10-6突变率 -寻找正向突变菌株 2、定向培育优良菌种 牛型结核杆菌-13年-230代-卡介苗（减毒活菌疫苗）,（二）诱变育种,诱变 + 筛选 诱变是随机的；筛选是定向的 目前发酵工业生产菌株都是经过突变改造过的。,1、诱变育种的基本规律,2、诱变育

17、种中的几个原则 诱变剂的选择,1 诱变剂作用的普遍性：选择那些在其它菌种选育中诱变效果好的诱变剂。如：UV ，亚硝基胍（NTG），快中子等。 2诱变剂的特异性：经验之谈。 如，四环素族抗生素用亚硝酸、羟胺， 青霉素用氮芥、乙烯亚胺、亚硝基胍,3*菌株的差异：（即使是同一菌） A：遗传性不稳定的菌株-用缓和诱变剂 B：遗传性稳定的菌株-首用强，后用缓。 *考虑诱变机制：UV 嘧啶， 亚硝酸 嘌呤，因此复合用为好,2、诱变育种中的几个原则 诱变基本过程,选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大试验,出发菌株的选择,出发菌株用来育种处理的起始菌株 出发菌株应具备 对诱变剂的

18、敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力； 出发菌株的来源 自然界直接分离到的野生型菌株： 历经生产考验的菌株： 已经历多次育种处理的菌株：,（4）.制备单细胞或单孢子悬液 要求 菌体处于对数生长期， 细胞分散且为单细胞， 方法： 玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐温80 用无菌脱脂棉过滤。 制备：物理诱变剂生理盐水 化学诱变剂缓冲液 浓度： 细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml,（5）诱变剂剂量的选择,用90-99%杀菌剂量 用5085%的杀菌剂量，此时正突变率高，特别是出发菌株已是高产菌株。,（6）诱变剂的处理方法,诱变剂使用方式 单一处理 复合处理： 诱变处理

19、条件：温度（生长温度） PH（缓冲剂） 处理时间 诱变作用的终止：用解毒剂、用水稀释,（7）突变株的筛选,筛选条件：基因型+环境 表型 表型迟延 充分表达 分离性迟延现象 生理性迟延现象,（7）突变株的筛选,合适的筛选方法 ：,平皿快速检测法 变色圈法 透明圈法 生长圈法 抑菌圈法 梯度平板法 摇瓶培养法,第一轮： 一个出发菌株 选出200个菌株 选出50株 选出5株,诱变处理,初筛,（每瓶一株）,复筛,（每瓶四株）,第二轮： 5个出发菌株 选出50株 选出5株,40株 40株 40株 40株 40株,诱变处理,初筛,复筛,（每瓶一株）,（每瓶四株）,3、三类突变株的筛选,产量突变株筛选 抗药

20、性突变株的筛选（梯度平板法） 营养缺陷型(auxotroph)的筛选,产量突变株筛选,琼脂块培养法（春日霉素） 孢子悬液-诱变-适当培养（表型迟延）- 涂布平板-打孔取菌落-琼脂块培养-4-5天 测定琼脂块所含的抗生素的抑菌圈-效价高菌,抗药性突变株的筛选（梯度平板法）,抗药性突变株的应用： *作为菌株的遗传标记 *作为生产菌种（结构类似物抗性突变株） 如“吡哆醇高产菌株的筛选”,营养缺陷型(auxotroph)的筛选,A：有关的三类遗传型个体： 营养缺陷型突变株：必须在培养基内加入相应有机养分 野生型菌株：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。 原养

21、型菌株：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。,有关的三类培养基,基本培养基（MM）-：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。 完全培养基（CM）+：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。 补充培养基（SM）x：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。,筛选步骤,野生型菌株 C-1：诱变处理（同前讲述） C-2：淘汰野生型（浓缩缺陷型） C-3：检出缺陷型 C-4：鉴定缺陷型,C-2：淘汰野生型（浓缩缺陷型）,诱变后，仍存在大量的野生型，不利于分离 （1）抗生素法 野生型菌株在MM上生长+青霉素杀死

22、缺陷型菌株在MM上不生长青霉素-不杀死 注意： 使环境的渗透压提高，避免细胞破裂。抗生素处理完后，离心收集细胞，并转入低渗溶液 制霉菌素法则适合于真菌（例如：酵母、霉菌），可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起溶菌,（2）菌丝过滤法 适于：丝状（放线菌、霉菌） 原理：野生型基本培养基上发育成菌丝；缺陷型孢子不萌发可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。,检出缺陷型,逐个检出法 影印检出法 夹层培养法 限量补给法,逐个检出法,影印检出法,夹层培养法,限量补给法,在含少量的（0.01%）蛋白胨的MM上培养, 大菌落为野生型 小菌落的为缺陷型。,鉴定缺陷型,生长谱法 组合营养物法 组合补充培养基法,生长谱法,

23、斜面菌种-生理盐水洗下细胞-洗涤-涂布（105个/皿）,纸片1:氨基酸混合液; 纸片2:维生素混合液; 纸片3: 核酸水解液; 纸片4: 酵母水解液,组合营养物法：,A 将多种营养因子编组； b. 将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养； c. 结果分析； 一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 13 14 五组：5 9 12 14 15,组合营养物法：,组合补充培养基法,如是多个缺陷型菌株， 则制成各营养组合平板，将带测菌株依次点接到这一组平板的对应位置上， 根据在各平板上的生长情况逐个分析各菌株的缺陷型 MM+A +B +C

24、 +A+B +A+C,4、 Ames test：对化学诱变剂做检测,原理： his -在基本培养基上不长；而发生回复突变则长。 菌种：鼠伤寒沙门氏菌 his -；,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组,原核生物的基因重组,凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（gene recombination）或遗传重组。 作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。,重组与杂交的关系,重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交 而一般所说的杂交（hybridization）则是细

25、胞水平上的一个概念。 杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。,一、原核微生物的基因重组,特点： 片段性：仅一小段DNA 单向性：共体 受体 转移机制多样性： 转化、 转导、 接合、 原生质体融合,（一）转化,受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的受体菌称为转化子（transformant）。 来自供体菌的DNA片段称为转化因子,1、转化发生的条件,（1）两个菌株间的亲缘关系密切 （2）受体细胞要处于感受态. （3）供体DNA片段（转化因子）大小适宜，分子量一般为1 106 D 左右，15个基因

26、 感受态：受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,（4）单链供体DNA进入受体菌，发生同源重组； （在受体菌表面，一条链被水解） （5）DNA复制，受体细胞分裂，带有新形状的个体为转化子,转染,把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染（transfection）。,（二）转导（Transduction）,借助缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞中DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称转导。 获得新遗传性状的受体细胞称为转导子（transductant）。转导过程不

27、需要细胞接触，而是以噬菌体为载体,转导主要分为： 完全普遍性转导 普遍性转导 流产普遍性转导 低频局限性转导 局限性转导两种类型 高频局限性转导,（1) 普遍性转导（Generalized transduction）,由于完全缺陷型噬菌体携带了供体菌染色体片段，当它去感染受体菌时，使后者获得这部分遗传性状的现象称为普遍性转导,完全普遍转导条件,供体菌-野生型（鼠伤寒沙门氏菌 ） 受体菌-各种营养缺陷型 完全缺陷型噬菌体-P22，感染复数1 特点：供体的任何基因都有可能进入受体细胞,（2）局限性转导 Restricted transduction,是指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基

28、因携带到受体菌中并获得表达的转导现象。,（2）局限性转导 Restricted transduction,条件： 供体菌-大肠杆菌K12（）溶源菌（野生型） 受体菌-营养缺陷型（Bio-，gal-） 部分缺陷温和性噬菌体- d 特点： 只传递供体菌的少数特定基因,正常噬菌体和转导半乳糖（gal）的缺陷型噬菌体(dg)的形成过程,发生误切频率10 4 10 6 因此 形成转导子的频率低 条件：感染复数m.o.i1,低频转导,高频转导,条件：当感染复数m.o.I1 受体菌变为形成双溶源菌 E.coliK12(/dg) UV,转导噬菌体（ dg）50% + 辅助噬菌体（ ）50%,再次侵染其他受体细

29、胞 ，m.o.I1,侵染的50% 受体菌变为转导子,（3）、溶源转变,当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。 性质：表面上与转导相似，而本质上不同于转导。,（3）、溶源转变,区别： 当宿主丧失其原噬菌体时，通过溶源转变而获得的新性状也随之消失 温和噬菌体不携带来自供体菌的外源基因，是噬菌体自身基因使宿主获得新性状 温和噬菌体使完整的，不是缺陷的 获得新性状的是溶源化的宿主细胞，不是转导子,白喉棒杆菌：白喉毒素/温和噬菌体 肉毒梭菌：C型或D型肉毒毒素 红霉素链霉菌：合霉素合成和气生菌丝形成/P4温和

30、噬菌体,（三）接合,供体与受体细胞直接接触，借性菌毛传递DNA，在受体细胞中发生交换、整合，使之获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。 通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子conjugant）,1946年J.Lederberg等采用E.coli的两株营养缺陷型进行实验,大肠杆菌“接合”涉及到的菌株,F+（雄性）菌株： 含游离的F因子14个 ，有 性菌毛14根 Hfr（高频重组）菌株： 含整合的F因子，有性菌毛， F菌株 介于F+菌株与Hfr菌株之间，细胞中有游 离的、带小段染色体基因的环状F因子 F（雌性）菌株 ：没有F因子，无性菌毛,接合：雌性菌 X 雄性 F+菌株 Hfr菌株 F菌株

31、从自然界分离到的2000株E. coli中约有30%是F菌株。,F（雌性）菌株接合,（1）F+ F F+ F+ （2）Hfr F Hfr + F （在大多数情况下） Hfr F Hfr + Hfr（或 F+） （极少数情况下） （3）F F F+ F 注意：接合实验所用到的F- 菌株是一系列营养缺陷型菌株，当发生重组时，变成原养型,接合的结果转性率高，染色体基因重组率低,Hfr菌株中F因子的整合、断裂和转移,Hfr的接合中断实验,接合的结果转性低，染色体基因重组率高,Hfr的中断杂交实验,F因子在Hfr菌株中的染色体上： 插入位点有几个 可以正向，可以反向插入 构成了Hfr1菌株、 Hfr2菌

32、株、 Hfr3一系列菌株，相对稳定 通过中断实验，划出了环状染色体图,F转导1,初生F菌株,F转导2,次生F菌株,（四）原生质体融合,原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程。 应用原生质体融合技术后，细胞间基因重组的频率大大提高了，在某些例子中，原生质体的重组频率已大于10-1,主要步骤,选择亲株、 制备原生质体、 原生质体融合、 原生质体再生 筛选优良性状的融合子。,选择亲株,选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。 参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等。 诱变剂对原种进行处理来获得这些遗传标记。 应先测

33、定菌株各遗传标记的稳定性，自发回复突变的频率低,原生质体制备,一般都采用酶解法去壁。 根据微生物细胞壁的不同，需分别采用不同的酶，如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。 有时需结合其它一些措施，如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性。,原生质体融合,聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合 一般PEG的使用浓度范围在25-40%。 原生质体只需要与PEG接触一分钟， 紫外线照射或脉冲电场等物理因素处理也能促进原生质体融合。,原生质体再生,就是使原生质体重新长出细胞壁 ，恢复完整的细胞形态结构。 不同微生物的原生质体的最适再生条件不同。但最重要的一个共同点是都需要高渗透

34、压。 细菌一般再生率为3-10%。,筛选优良性状融合重组子,直接法将融合液涂布高渗再生选择培养基平板上，直接筛选出原养型重组子； 间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，表型延迟后，再涂布高渗再生选择培养基。,原生质体融合的优点：,可以提高重组率 可进行多亲本融合 有利于不同种间、属间微生物的杂交 通过原生质体融合提高产量,二、真核微生物的基因重组,有性杂交 准性杂交 原生质体融合 遗传转化,（一）有性杂交,一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。 凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都能采用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。,亲本的单倍

35、化 有性杂交 杂交后代的检出 筛选优良性状个体,工业上应用的酿酒酵母通常是双倍体酵母菌，并且只进入无性世代。 要使这些酵母菌发生基因重组，应先诱使其产生子囊孢子， 再使两个不同性状的亲本发生接合，形成二倍体的杂交后代。,酒精酵母 面包发酵 产酒率高 对糖的利用能力强 子囊孢子 子囊孢子 杂交二倍体,（二）准性杂交育种（parasexual hybridization）,准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更原始的生殖方式， 准性生殖可发生在同一生物的二个不同来源的体细胞之间，经细胞融合但不发生减数分裂，导致低频率的基因重组,准性生殖的过程,菌丝联结 异核体形成（质配） 核配形成杂合二倍体 体细

36、胞交换和单倍体化。,菌丝联结,发生在一些形态上无区别，但遗传特性有差别的两个同种亲本的体细胞之间，发生的频率较低。,异核体形成（质配）,同一菌丝含有不同遗传性状的细胞核。 具有野生型性状（基因互补功能），可在基本培养基上生长 ； 异核体的分生孢子不能在基本培养基上生长；,核配形成杂合二倍体,异核体中的二个核偶尔会发生核融合或核配( caryogamy)，形成杂合双倍体。它较异核体稳定，产生的孢子比单倍体菌丝产生的孢子大一倍。 杂合二倍体产生的分生孢子能在基本培养基上生长；,体细胞交换和单倍体化,杂合体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂的过程中，能发生体细胞染色体间的交换、分离（单倍体化）而产生

37、具有新性状的单倍体杂合子、双倍体及非整倍体。,第四节 基因工程,基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术,第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,一、菌种的衰退与复壮 1、衰退（degeneration） ： 菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退,常见的衰退现象,菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力

38、减弱等。 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降,2、菌种的复壮（rejuvenation）,使衰退的菌种恢复原来优良性状。 狭义的复壮从衰退的群体中找出未衰退的个体， 广义的复壮：利用自发突变（正变）不断地从生产中选育优良菌种,菌种的复壮措施：,纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。 通过寄主体内生长进行复壮； 淘汰已衰退的个体,3、防止菌种衰退的方法, 控制传代次数 选择合适的培养条件； 采用不宜衰退的细胞进行传代 采用有效的菌种保藏方法。,二、菌种保藏：,1. 目的： 存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种,二、菌种保藏：,2. 原理：

39、（1）首先选用优良的纯种，最好是休眠体，（如分生孢子、芽胞等）， （2）其次创造长期降低微生物代谢强度，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等）,3.菌种保藏的方法,菌 连续在培养基上（内） 移种 种 生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种 保 固体斜面 藏 湿法 半固体琼脂柱 方 休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液） 法 干法 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上,方法,低温保藏法 方法：菌种管置4冰箱保藏，定时传代 ，3-6月 石蜡油低温保藏法： 橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。1-2年,（3）干燥保藏法 将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法， 适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间1-10年。,真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。5-15年 液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（ -196）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。 15年以上,国内外菌种保藏机构外菌种保藏机构国内外菌种保藏机构,中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）,