《细胞化学染色2009-2-25.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞化学染色2009-2-25.ppt（64页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、第二节 细胞化学染色 (cytochemical stain),临床检验与输血学系 胡嘉波,概述,细胞化学 (组织化学，组化)染色以形态学为基础并结合化学或生物化学技术，对细胞内各种化学成分、代谢产物作定位、定性和半定量检查的一门科学。可弥补单纯细胞形态学检查识别的不足。,细胞化学染色临床意义: 1.辅助判断急性白血病的类型。仅从细胞形态学观察白血病的诊断正确率约5070%，如结合细胞化学染色则可提到90%以上。 2.辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断。,不同细胞化学染色，染色步骤不同，但基本步骤为固定、有色沉淀反应及复染。,1.固定 为了保持细胞结构及化学成分的不变，需对细胞进行固定。根据染
2、色的成分不同，选择合适的固定液，使细胞内的蛋白质、酶类、糖类等变成不溶性物质。固定的方法有物理法和化学法，临床上常用的是化学法固定。物理法包括干燥和火焰固定；化学法包括蒸汽固定和液体固定，如甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等。,2. 有色沉淀反应,通过不同化学反应，使被检测的化学物质最终形成稳定的有色沉淀。列举以下三种化学反应： （1）偶氮偶联法：含萘酚的底物，在相应酶的作用下释放出萘酚，萘酚与重氮盐（如坚牢蓝紫酱GBC、坚牢蓝B、六偶氮付品红等）结合，偶氮偶联形成有色沉淀。如NAP染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色、ACP染色等。,（2）普鲁士蓝反应：铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成如亚铁氰化铁蓝色沉
3、淀，如铁染色。 （3）雪夫反应: 过碘酸氧化细胞内糖类中的乙二醇基形成乙二醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀物，如过碘酸-雪夫反应。,3.复染,目的在于使各种细胞能显示出来便于观察。选择复染液的颜色应与有色沉淀的颜色有明显的对比度，即能使细胞结构显示又能清楚地看出细胞化学染色结果。如铁染色复染常用中性红，过碘酸-雪夫反应常用甲基绿。对核着色效果较好的有中性红、甲基绿、苏木精、核固红、沙黄等，使浆着色较好的有伊红、刚果红、光绿等。,一、过氧化物酶染色（POX）,【原理】 粒细胞和单核细胞的胞浆中含有髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）,能将底物H2O2分解，产生
4、新生态氧，它能够将四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢氧化，则显棕色四甲基苯醌二胺。若加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结合，可形成稳定的蓝色颗粒，定位于细胞浆酶所在部位。,骨髓片POX染色,骨髓片POX染色,APL：呈强阳性反应,AML-M4：部分呈阳性反应， 部分成弱阳性反应,AML-M5：呈弱阳性,ALL：呈阴性，3%,正常血细胞的染色反应,过氧化物酶主要存在于粒细胞和单核细胞中。原粒大多呈阴性反应，部分可出现少量阳性颗粒。自早幼粒细胞起至成熟中性粒细胞均呈阳性反应，并随着细胞的发育成熟阳性反应程度逐渐递增，中性分叶核粒细胞呈强阳性反应。 淋巴细胞、幼红细胞、巨核等均呈阴性反应。,PO
5、X染色临床意义,主要有助于急性白血病类型的鉴别 （1）急粒其白血病性原粒细胞可呈弱阳性反应，颗粒粗大，呈局灶性分布；急淋其原淋细胞和幼淋均呈阴性反应；急单时白血病性原单呈阴性反应或弱阳性反应，颗粒细小，呈弥散分布。 （2）急单与恶性组织细胞白血病鉴别：异常组织细胞 POX染色呈阴性反应，急单白血病细胞呈弱阳性反应。,二、苏丹黑B染色,【原理】 苏丹黑B（Sudan black B，SBB）是一种脂溶性重氮染料，能溶解细胞内的含脂结构（如中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇）中，而使脂类物质显示出来，呈棕黑色或深黑色。脂类物质在粒细胞中丰富，单核细胞中也有少量。,【正常血细胞的染色反应】 结果与POX染
6、色基本一致。 【临床意义】 本染色临床意义与POX染色基本相似。 【方法评价】过氧化物酶染色要求涂片新鲜，保持酶活性，才能得出正确结果，而苏丹黑B染色则无此要求。虽然SB染色临床意义基本同POX染色 ，但其灵敏度及特异性两者有所不同。SB染色的特异性低于POX染色，POX阳性见于髓系细胞，而SB阳性也可见于淋系细胞；但SB染色的敏感性高于POX染色，例如急性粒细胞白血病POX染色阴性的患者，其SB染色可阳性。,三、中性粒细胞NAP染色,【原理】 中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶能水解磷酸萘酚钠，释放出萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀定位于酶活性处。,中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）,+
7、,+,+,+,+,+,-,嗜酸粒细胞-,NAP积分 油镜下计数100个中性杆状核、分叶核粒细胞，分别记录其分级情况，全部阳性细胞之和即为阳性率。将得出各种积分的百分率乘以该积分数，再相加即为积分值。 例：4分 占20 4 x 20=80分 3分 占40 3 x 40=120分 2分 占18 2 x 18=36分 1分 占10 1 x 10=10分 0分 占12 0 x 12=0分 阳性率88 积分=246分,NAP临床意义,1.细菌与病毒性感染的鉴别：前者增高，后者降低。 2.类白与慢粒的鉴别：前者增高，后者降低。 3.急性白血病类型鉴别：急粒NAP积分值减低，急淋NAP积分值增高。 4.PN
8、H与再障鉴别：前者减低，后者增高。 5.真红增多症与继发性红细胞增多症鉴别：前者增高，后者无明显变化。 6.白血病前期与增生性再障的鉴别：前者NAP积分减低，后者增高。,四、酸性磷酸酶染色,【原理】 酸性磷酸酶（ACP）存在于细胞的溶酶体颗粒中，有些细胞中的酸性磷酸酶耐酒石酸，故抗酒石酸酸性磷酸酶染色有助于某些疾病的诊断及鉴别诊断。染色方法有偶氮偶联法和Gomori硫化铅法，以前者为常用。,偶氮偶联法 血细胞内的酸性磷酸酶在酸性（pH5.0）条件下水解基质液中的磷酸萘酚AS-BI，释放出萘酚AS-BI，后者与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮
9、盐为六偶氮付品红，形成红色的沉淀。,抗酒石酸酸性磷酸酶染色 用相同方法制备两份基质液，一份再加入适量的L-酒石酸（tartaric acid）,另一份不加酒石酸。取两张相同标本的涂片，分别用这两种不同的基质液做酸性磷酸酶染色。如果血细胞内的酸性磷酸酶耐L-酒石酸，两张均呈阳性；如不耐L-酒石酸，不加L-酒石酸呈阳性反应，而加L-酒石酸呈阴性反应。,阳性反应为鲜红色或深红色颗粒，定位于胞浆。 所有血细胞的酸性磷酸酶染色均为阳性，但是单核细胞、组织细胞、巨核细胞和毛细胞反应较强。 抗酒石酸酸性磷酸酶染色：毛细胞白血病的毛细胞出现强阳性反应。除少数淋巴细胞表现弱阳性反应外，粒细胞、单核细胞和巨核细胞
10、皆为阴性。,临床意义：,帮助诊断多毛细胞白血病：毛细胞呈阳性（常呈强阳性），阳性反应不被L-酒石酸抑制。慢性淋巴细胞白血病的淋巴细胞和恶性淋巴瘤细胞ACP染色也可呈阳性，但可被L-酒石酸抑制。但ACP阴性者，并不能排除多毛细胞白血病的可能性。 帮助鉴别T细胞与B细胞：TL（+），BL（-） 帮助鉴别Gaucher病与Niemanm-Pick病。 单核、组织、网状、巨核细胞ACP染色均呈阳性反应。,五、过碘酸雪夫反应,【原理】 细胞内含有乙二醇基的糖基在高碘酸的氧化作用下产生双醛基，后者与雪夫（Schiff）染料作用，使无色品红变为紫红色染料沉积，定位于含有多糖成分的部位。根据胞质中糖原含量多少
11、，可呈现粗细不等红色颗粒、块状物或均匀红色。在高碘酸氧化前，用麦芽糖淀粉酶或唾液淀粉酶处理标本，再作PAS染色，可鉴别是糖原还是其它多糖类物质，如被消化则是糖原，如不被消化则为其它多糖类物质。亦称糖原染色。,PAS临床意义,1.红血病、红白血病及贫血类型的鉴别：红血病、红白血病、重型地贫及缺铁贫以及MDS时幼红细胞呈强阳性，但极少数红白血病可呈阴性；溶贫时幼红细胞呈阴性或弱阳性；再障、巨幼贫时幼红细胞呈阴性。 2.白血病类型的鉴别：急粒时原粒呈阴性或弱阳性，以弥漫性为主；急淋时原、幼淋多呈块状阳性反应，少数呈阴性反应；急单时原、幼单核细胞呈阳性反应，其颗粒细小，弥散分布。,3.巨核细胞与里斯（
12、Reed-Sternberg）细胞的鉴别：前者呈强阳性，后者呈阴性或弱阳性。 4. Gaucher细胞与Niemanm-Pick细胞的鉴别：前者为强阳性，后者为阴性或弱阳性。,Sternberg,六、酯酶染色,不同血细胞中所含酯酶的成分不同。根据酯酶特异性高低分为特异性酯酶（SE）和非特异性酯酶（NSE）。特异性酯酶就是指氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色；非特异性酯酶的种类有多种，根据pH值不同分为酸性、中性和碱性酯酶，包括了酸性非特异性酯酶（即酸性- 醋酸萘酚酯酶）、碱性非特异性酯酶（即-丁酸萘酚酯酶）和中性非特异性酯酶，后者包括- 醋酸萘酚酯酶、醋酸AS-D萘酚酯酶等。目前显示血细胞中酯酶的方法
13、均采用偶氮偶联法。,（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色,【原理】 血细胞内的氯乙酸AS-D萘酚酯酶（naphythol AS-D chloroacetate esterase，NAS-DCE）水解基质液中的氯乙酸AS-D萘酚，产生AS-D萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有色沉淀为红色。NAS-DCE几乎仅出现在粒细胞、其特异性高，因此又称为“粒细胞酯酶”。,1中性成熟粒细胞，呈强阳性；2淋巴细胞，呈阴性；4单核细胞，呈阴性；5幼红细胞，呈阴性,急粒M1氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色图 1原粒呈阳性；其他原始粒
14、细胞均呈阴性,【正常血细胞的染色反应】 1.粒系 分化差的原粒呈阴性，分化好的原粒呈阳性，自早幼粒至成熟中性粒均呈阳性，但酶活性并不随着细胞的成熟而增强。嗜酸性粒细胞呈阴性或弱阳性，嗜碱性粒细胞呈阳性。 2.单核系 绝大多数为阴性，仅个别单核系细胞呈弱阳性。 3.其他细胞 如淋巴细胞、浆细胞、巨核细胞、有核红细胞、血小板等均呈阴性，肥大细胞阳性。,【临床意义】 主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型，是急性白血病的常规细胞化学染色。急粒时原粒呈阳性或阴性，所以染色结果为阴性者不能排除急粒可能性；M3时早幼粒细胞呈强阳性；急单时原单及幼单细胞几乎均呈阴性，个别细胞弱阳性；M4时原粒及早幼粒呈阳性，原
15、单及幼单细胞呈阴性；急淋和急性巨核细胞白血病均呈阴性。,（二）醋酸萘酚酯酶染色（NAE）,【原理】 该酶主要存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，是一种中性非特异性的酯酶。血细胞内的-NAE在pH中性条件下，水解基质液中的- 醋酸萘酚并释放出-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢蓝B，形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色。单核细胞系统的阳性可被氟化钠抑制，所以做-NAE染色时，通常同时做氟化钠抑制试验。,【正常血细胞的染色反应】,1.单核系 分化差的原单呈阴性，分化好的原单呈阳性（常较强），幼单及单核也呈阳性，阳性反应能被氟化钠抑制。
16、所谓抑制是指氟化钠试验的抑制率大于50%。 2.粒系 阴性或阳性，但阳性反应不能被氟化钠抑制。 3.淋系 多数阴性，少数弱阳性，不能被氟化钠抑制。 4.其他细胞 巨核细胞和血小板呈阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；少数有核红细胞呈弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；浆细胞呈阴性。, NAE临床意义,1. 有助于急性白血病类型鉴别：急性单核细胞白血病时白血病细胞呈强阳性反应，且能被氟化钠抑制，故在染色时要同时做氟化钠抑制试验；急性粒细胞白血病时呈阴性反应或弱阳性反应，阳性反应不被氟化钠抑制。 2.红血病和红白血病时异常幼红细胞可呈阳性反应。 3.巨幼红细胞性贫血时巨幼红细胞也可呈阳性反应。,10、铁
17、染色,【原理】 正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中。骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。,铁染色（ferric stain）化学反应过程如下： 酸性 4Fe 3+ + 3K4 Fe（CN）6 Fe4 Fe（CN）6 3 + 12K+ （含铁物质） （亚铁氰化钾） （亚铁氰化铁）,【结果】,幼红细胞核呈鲜红色，浆呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。 细胞外铁 用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。 （-）：无颗粒。 （+）：有少数铁颗粒或偶见铁小珠(颗粒体积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者称为铁珠)。
18、（+）：有较多的铁颗粒和小珠。 （+）：有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状。 （+）：有极多铁颗粒、小珠，有很多的小块，密集成堆。,细胞内铁 用油镜计数100个中、晚幼红细胞，记录胞浆中含有蓝色铁粒的红细胞(铁粒幼红细胞)的百分率。根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布的情况，将铁粒幼红细胞分为四型。 型：幼红细胞内含铁粒12个。 型：幼红细胞内含铁粒35个。 型：幼红细胞内含铁粒610个。 型：幼红细胞内含铁粒11个以上。,环形铁粒幼红细胞 环形铁粒幼红细胞的标准为含铁粒在6个以上，围绕核周12以上者。 有时成熟红细胞中也出现铁颗粒称为铁粒红细胞。,铁染色的临床意义,1、鉴别缺铁性贫
19、血、铁粒幼细胞性贫血及某些溶血性贫血 缺铁性贫血时骨髓细胞外铁和内铁显著减少或消失，经铁剂治疗后细胞外铁及内铁可迅速增多，此检查是诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的一种辅助方法；非缺铁性贫血，如溶血性贫血、巨幼红细胞性贫血等病人的细胞外铁可以增高，因此有助于鉴别缺铁性贫血与非缺铁性贫血。,2、用于诊断铁粒幼细胞性贫血 能找到数量不等的环形铁粒幼细胞，多见粗颗粒的型与型铁粒幼细胞。,表4-2-10 几种常见急性白血病的细胞化学染色结果,第三节 骨髓活体组织检查,概述,骨髓活体组织检查(bone marrow biopsy， BMB)简称骨髓活检，是观察骨髓组织结构和空间定位，补充骨髓涂片检查的一有效
20、方法。能有效反映骨髓组织结构及间质成分的变化，了解骨髓造血组织的结构和细胞之间和组织之间的相互关系，对很多血液系统疾病的诊断都具有重要意义。,一、骨髓活检适应症,1. 骨髓穿刺多次失败（怀疑骨纤、骨髓转移癌、MM、毛白、某些急、慢白及骨髓硬化症等）。 2. 血象显示全血细胞减少，反复骨髓穿刺均为“血稀”或骨髓增生低下，病态造血，怀疑再障、MDS及低增生性白血病的患者。 3. 某些贫血、原因不明发热、脾或淋巴结肿大、骨髓涂片检查不能确诊者。 4. 对白血病疗效的观察有指导价值。有时骨髓涂片已达到完全缓解，但骨髓活检切片内仍可检出白血病性原始细胞簇 。,骨髓穿刺与骨髓活检,CML 骨髓切片,MDS骨髓切片,骨髓活检的临床意义,1可较全面而准确地了解骨髓增生程度，造血组织，脂肪细胞或纤维组织所占的容积比例；了解粒/红比值及骨髓内铁储存情况，对于某些疾病及化疗后骨髓抑制程度有明确的诊断价值。 2可以发现骨髓穿刺涂片检查不易发现的病理变化。,