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1、教 师：李伟国 资料收集：杨延玺 易胜 王涛 则巴古力 董兴 冯莹 赖照明 刘亚京 资料整合：杨林芳 吴菲菲 余星星 PPT制作：刘亮 讲 课：曾栋梁,生物化学实验设计报告 蛋白质的提取、纯化以及检测,已知某蛋白的分子量约为17 kDa，等电点3.94.1，它能耐一定的高温，在90 C加热34 min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂。,题目解析,在钙离子的作用下才能起到暴露疏水集团发挥性能，结合蛋白质基础知识从而可以判断其为钙调蛋白。,钙调蛋白的简单介绍,钙调蛋白（英语：Calmodulin，又称
2、钙调素、携钙素，简称CaM），是一种能与钙离子结合的蛋白质，普遍存在真核生物细胞中。钙调素由148个氨基酸组成（分子量为16700）；含有大量酸性氨基酸（有1/3是谷氨酸和天冬氨酸），为酸性蛋白质（等电点为4.3）。钙调素含有4个EF手结构片断，其中每一个都可以结合一个钙离子。 钙调蛋白是一种钙结合蛋白，存在于几乎所有的真核细胞中。它的作用是对任何微量的钙都能敏感地捕获。钙调蛋白只有在与Ca2+结合后才有活性。与钙结合后，CaM发生构型上的变化，成为一些酶的激活物。 因不含有易氧化的络氨酸、半胱氨酸，因此十分的稳定,实验设计框架,实验方法：热变性吸附层析法，基因重组大 肠杆菌法（论文无法下载）
3、,蛋白检测：分为定性检测和活性检测,实验总结：总结当前实验,第 18 卷第 4 期Journal of Shanxi Teachers University Vol. 18 No. 42004 年 12 月Natural Science Edition 动物脑组织中钙调蛋白的分离纯化 袁丽环, 段江燕,实验方法,试剂准备： 新鲜鼠脑；标准钙调蛋白；PDE；Pipes； BufferA：10 mmol/L Pipes, 1 mmol/L EDTA, pH=7.0; BufferB：10 mmol/L Pipes, 1 mmol/L CaCl2, pH=7.0; BufferC：50 mmol/L
4、 Tris-HCl, 0.5 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA, pH=8.0; 测定Buffer：360 mmol/L Tris-HCl，360 mmol/L 咪唑，4.5 mmol/L MgAc2。,实验方法,仪器准备： TGL-16L-A 高速冷冻离心机； 2001-B-C七件套豪华层析系统； UV-2201紫外分光光度计。,钙调蛋白的粗提取,取新鲜的鼠脑共20 g ， 切碎并于100 mL BufferA 中匀浆 将匀浆液置100 水浴中煮沸 3 min ， 冷却后离心 10000rpm， 60min. 取上清液调成2 mmol/L CaCl2 溶液。,取样，采用
5、离心法：,钙调蛋白提取,粗样品的纯化：（吸附层析法）,装柱： 采用葡聚糖G -5 0 ( 分离蛋白质的范围在 1.5103-3104 ) 用蒸馏水浸充分膨胀( 3 h-4 h ) 后再装柱； 平衡： 用提取钙调蛋白的缓冲溶液BufferA平衡； 上样： 经过平衡的凝胶过滤柱。 当平衡液流动到与固定相表面一致时， 用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面， 要尽量避免冲毁基质 加入样品液的体积一般应少于床体积的1/2; 洗脱： 待样品液的液面流到固定相表面时， 用50 mL BufferB 淋洗之后用200 mL 0.5 mol/L NaCl 的BufferB淋洗， 最后用BufferC洗脱；
6、 收集： 在进行洗脱的同时柱的下端与部分收集器接通。按时间分管收集，每管滴2 min ，流速控制在大约1.5 mL/ min。,钙调蛋白的定性检测,如图，倘若两者最大吸收峰以及峰形基本重合，那么可以判断该物质即为钙调蛋白,采用紫外光谱法：,钙调蛋白的活性检测,根据磷酸二酯酶( PDE) 可特异地把环核苷酸水解为 5- 核苷酸, 并在蛇毒中的核苷酸作用下, 进一步水解成腺苷和磷酸. 而钙调蛋白可以激活 PDE, 从而使最终的产物无机磷的量增加, 因此可依据磷的含量判断钙调蛋白的生物学活性.,机理图如下,对活性的计算存在以下定量关系：,采用PDE法：,实验总结,本文通过动物脑组织为材料经热变性、离心、葡聚糖SephadexG-50分离纯化，通过紫外吸收图谱、二步酶解法检验钙调蛋白的纯度、浓度。说明此方法可分离纯化得到具生物活性的钙调蛋白，且取材容易，简便经济，为进一步研究钙调蛋白的结构与功能提供了快捷省时的提纯方法。,实验总结,谢谢！,