细胞生物学 第三章.ppt

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1、第三章 细胞生物学研究方法 一、细胞形态结构观察 一光学显微镜 普通光镜的性能指标：放大率（放大倍 数），分辨力，清晰度、焦点深度，镜象亮 度 分辨力（分辨率、分辨本领）：能分辨两 个物点之间最短距离的能力，通常是以分辨 距离来表示的，即分辨距离越小，则分辨力 越高。 人肉眼分辨力测试，是规定在明视距离为 25cm所分辨的最短间距来表示，正常人肉眼 分辨力的极限值是0.1 mm毫米。显微镜的分 辨力可按下列公式来计算 : R=0.61 / NA （R是分辨距离，0.61是常数，是照明光波波长 ，NA是显微镜物镜的镜口率光学性能指 标，每个物镜的外壳上都标有其镜口率的数值 ）。 分辨距离R与镜口

2、率NA成反比关系 若把最大镜口率1.25（ 即油镜镜口 率）代入公式，可见， 最小分辨距离 。 由于可见光中最短波长（紫光）0.4m （即400nm）， 普通光镜最大分辨 力的理论极限应为0.2m。 请记 住 0.2 ! 这个数值就是显微 水平与亚（超）微水平的分界线。 显微镜的分辨力有一定的极限， 其放大率受分辨力制约而不可能无限 提高。 普通光镜放大率的经验界值 ：有效放大倍数极限 物镜最大镜口 率1000 例： 普通显微镜的油镜镜口率为 1.25，故此台显微镜的最大有效放大倍 数为1250倍。 高级研究显微镜的油镜镜口率为1.4 ，则此镜的最大有效放大倍数为1400 倍。 如果放大倍数超

3、过限度， 则视野中物 象会变模糊 ，细微结构反倒分辨不清 ，成为了 无效放大。 由于物镜镜口率 受入射镜口角和介质折射率的限制， 不可能再更进一步提高了。 所以科学 家们从另外两个途径来改进显微镜： i.换用短波长的“照明光源”，来提高 分辨力。如： 紫外光显微镜、电子显 微镜 ii.应用特殊光学效应， 增强反差， 来 提高分辨能力。 如：相差显微镜、微 分干涉显微镜 相差显微镜 phase contrast microscope 原理：光波的三个光学特性：（1）光波有 波长。 对于光波波长变化，肉眼觉察为颜色变 化;（2）光波有振幅。 对于光波振幅变化（即 振幅差），肉眼觉察为明暗变化； （

4、3）光波 有相位（ 相位是指某一时刻， 光在其前进路 线上的位置）。对于光相位的变化（即相位差 ），肉眼是不能觉察的。 当光线穿过无色透明且非匀质的被检物体（ 如活细胞），其波长和振幅都无明显变化，仅 光相位出现了一定程度的变化，此时观察会感 觉反差较小，对物体内部的结构难分辨，这就 是普通光镜不适宜用于观察活细胞的原因。 相差显微镜却是运用一些特殊装置，使通 过被检物体的光线分离成两组光波，并人 为地促使这两组光波之间微弱的相位差加 大，再经过光波干涉作用，使看不见的相 位差转变成可见的振幅差，从而造成反差 增强，便能够清晰看到被检物体及其内部 细微结构了。所以，相差显微镜下的样品 标本不需

5、染色，即可以十分清晰地观察活 细胞及其内部结构的变化。 特点： 相差显微镜的观察效果是被检物 体比其周围背景略暗，而物体外围显现有 一圈明亮的光环。 倒置显微镜则是将相差显微镜的构 件颠倒装配，本末倒置而成的，并 装有恒温设备、闭路电视和缩时摄 象机，是能够完善适用于细胞培养 的观察监视系统。 微分干涉显微镜却是另一种不需染 色而可以直接观察活细胞精细结构 及动态变化的技术设备，其分辨率 比普通光镜要提高一个数量级。 3.荧光显微镜 fluorescence microscope 原理：以紫外光为光源，使被检材料 中的荧光物质激发出荧光，从而对细 胞内某些物质进行定性和定位分析。 荧光现象有两

6、种：1.自发荧光细胞内 某些天然荧光物质被紫外光照射所 激 发 的 荧光， 例，叶绿素血红色 自发荧光；2.诱发荧光在细胞中加入 某种不会使细胞化学组分变性的荧光 染料（ 荧光素 ）， 与细胞内某种特 定成分结合在一起，经紫外光照射激 发出荧光。 例：荧光染料吖啶橙，可使RNA发 出红色荧光，而使DNA发出绿色荧 光。 结构特点：1 采用紫外光发生装置 ： 高压汞灯 + 激发装置 + 滤光装 置 2 透镜由石英玻璃制成 ，以便减少光通路上的紫外光损耗 3 目镜中要装压紫滤片 荧光显微镜目前在分子细胞生物学研究中应 用十分广泛，以荧光素标记各种探针进行基 因定位分析或对某些特定蛋白质进行定性定

7、位检测分析，灵敏清晰。在荧光显微镜下对 样品可同时采用两种以上荧光探针检测，依 据其不同颜色的荧光信号，我们能一次判断 识别多个基因（或蛋白）的位点，因此这是 非常实用的研究技术。例如，绿色荧光蛋白 GFP 可用于进行活体观察。 此外， 由于 在荧光标记检测实验中， 易发生一些非检 测目标出现假象的 “背景噪音” 问题， 因 而现可在荧光显微镜设备上安装一套“数字 成像处理系统”，即把图像信息通过摄像机 和电脑的图象数字化处理，使信号反差得以 放大增强，对假象削弱或消除，从而明显提 高检测的准确率和灵敏度。 激光扫描共焦显微镜 Laser scanning confocal microscop

8、e 激光扫描共焦显微镜的物镜和聚光镜是 聚焦于同一焦点之上，故能排除焦平面 以外荧光的干扰，因此其分辨率比普通 荧光显微镜要提高1.41.7倍， 并还能 以“光学切片”方式去观察较厚样品之 中的内部精细结构。 （二）电子显微镜 1.透射电镜 transmission electron microscope , TEM 透射电镜的成像光路图，与光镜的基本类似 。只不过是以电子枪所发射的高速电子流代 替了照明光源，又以三组电磁线圈所构成的 磁透镜代替了玻璃制成的聚光镜、物镜和目 镜。 第一组磁透镜能将电子流聚集到样品 上 （ 故称为会聚镜），第二组磁透镜能使 穿透过样品的电子射线折射形成初级放大象

9、 （称为物镜），而第三组磁透镜则是通过第 一、第二中间镜和投影镜进行连续三次的再 放大，最终投射到荧光屏上，使电子图象转 变成可见的光学图象。 特点： （1）照明光源不同； （2）放大倍数的调节方式不同。 是依靠改 变磁透镜的激磁电流强度来调节放大倍数的 。也就是说，电流强度的变化引起了磁场强 度的改变，而磁场强度的变化又使电子射线 的折射程度发生改变，因而放大倍数即随之 出现变化。 （3）具有高压稳压系统。 电子流的发射速 度及波长皆取决于电压的高低，通常透射电 镜的电压达几万十几万伏的高压。 （4 ）有高度真空的工作系统。因为高速运 动的电子流如果与空气中的微粒和分子碰撞 就会改变它的发射

10、方向，导致成像模糊。故 要求电镜内的工作系统（包括样品室）都必 须保持高度真空状态， 并且样品都必须脱 水。因此说，透射电镜不能用来观察活的样 品。 （5）样品厚度必须 3nm - - nm-m nm-m 成象机制 简单 简单 复杂 复杂 一般 简单 Nuclear magnetic resonance 核磁共振 Atomic Force Microscope 原子力显微镜 二、细胞生化分析 （一）组织化学和细胞化学染色法 histochemical and cytochemical staining methods 利用某种显色剂能与某种细胞成分特异 性相结合，显示特定颜色的原理，对组 织和

11、细胞内某些成分进行定位和定性分 析的研究方法。可对无机盐、蛋白质、 醛类、碳水化合物、脂类、核酸和酶类 等多种成分检测鉴定。 例：孚尔根反应（Feulgen） 特定显 示DNA的细胞化学技术。 其原理是， 经稀 盐酸水解打开DNA上嘌呤碱与脱氧核糖之间 的连接键，暴露出醛基，由于自由醛基能与 无色品红（希夫试剂）反应形成紫红色的化 合物，据此可对细胞内的DNA进行定性和定 位检测。 此外，由于其染色的深度与DNA 浓度是成正比关系，所以当孚尔根法染色后 ，再用显微分光度计测量，即可对细胞内的 DNA含量进行定量测定。 再例：Comori法显示酸性磷酸酶： 磷酸脂 磷酸根 磷酸铅 硫化铅（棕黑色

12、 ） 酶解 pH5.0 铅盐硫化铵 （二）免疫细胞化学immunocytochemistry 依据抗体能与对应的抗原自行相互识别 结合的免疫学原理，来检测特定蛋白质 在细胞内的分布状况。首先将某种抗体 联结上标记物（光镜观察用的标记物是 荧光素或酶；而电镜观察用的标记物是 胶体金），再与组织或细胞样品混合反 应，随后在光镜或者电镜下检查标记物 沉积的部位，即对抗原进行定位测定。 如果标记物是荧光素，则是在荧光显微 镜下检查荧光信号部位，以显示抗原所 存在的位置。 抗体与抗原结合的方式分直接法和间接法两种 ，直接法是先制备抗血清， 将抗体与荧光素结 合，然后再用其浸染样品，待荧光抗体与抗原 结合

13、反应后，再在荧光显微镜下鉴别抗原的存 在部位。而间接法的不同之处是在抗原抗体 初级反应的基础上，再增加一种能同初级抗体 发生结合反应的次级抗体（即“抗抗体”）， 从而使初级反应效果得到“放大”，以增强分 析观察的灵敏性和准确性。如果与抗体联结的 标记物是酶，则可采用与酶的底物反应， 产生 呈某种颜色的沉积物，再依据这种特定颜色沉 积物的出现位置，来对探测物质的定性定位分 析，这被称为酶标抗体法。 例如， 辣根 过氧化物酶 是常被用作标记物的酶， 该酶 可催化过氧化氢与二氨基联苯胺 发生氧化反应 ，形成棕色的沉积物，从而便于在光镜或电镜 下进行观察分析。 (三)显微分光光度测定技术 micros

14、pectrophotometry 细胞内各种化学成分对光的吸收均有专一的 波段， 例如核酸是吸收紫外光260nm光波， 氨基酸则吸收280nm光波。 此外，有些细胞 成分经过细胞化学染色技术处理后，也对可见 光波有特定的吸收光谱。依据这种特性，运用 显微分光光度计可对某些细胞成分进行定位和 定量分析。目前，最先进的显微光谱分析仪器 是流式细胞仪，它是采用激光作为光谱测量光 源，还采用了细胞流动系统和电脑数据处理系 统，所以，一秒钟可测定5000个细胞的多种参 数，例如 DNA含量、蛋白质含量、 细胞体积 和直径等等, 此外还可将含不同成分的细胞迅 速大量分离。 （四）显微放射自显影micror

15、adiography 依据照相原理，利用放射性同位素所发射出来 的射线 （主要是粒子）， 使感光材料（照 相乳胶）上产生潜影（此过程称为“曝光”， 即让照相乳胶上的溴化银还原成银），再经过 显影和定影，即可观察到用同位素标记的某种 物质在标本中的位置和数量。 常用的放射性同位素有 3H、14C、32P和35S等 。例如： 用3H标记的胸腺嘧啶核苷可测定 DNA的合成代谢；用3H标记的尿嘧啶核苷可研 究RNA的合成代谢， 用14C或35S标记可研究 蛋白质的合成。由于此技术灵敏度很高，是对 生物大分子进行精细定位的有效方法。 其操作过程： （1）同位素标记实验样品； （2）样品标本制备（包括固定

16、、包埋、切片或 超薄切片或滴片）； （3）涂布乳胶（在暗室）； （4）曝光（自显影，在暗盒内）； （5）显影、定影、清洗； （6）标本染色； （7）在光镜下或电镜下观察。 由于放射性同位素标记对人不安全，且 有操作步骤复杂、费时费工的缺点，因 此目前在基因定位研究方面大多改用非 放射性标记方式例如应用生物素标 记或地高辛标记来替代同位素，在生物 素或地高辛上联结荧光素或酶，再以荧 光显微镜或酶联反应来检测，效果亦同 样很好。 （五）超速离心技术ultracentrifugation 是细胞生化分析研究的基础实验方法，是分 离纯化细胞亚微结构和生物大分子的重要技 术手段。超离心可达几万几十万转/

17、分（ g）的高转速，各种细胞亚微颗粒在离心场 中的沉降速率不一样，衡量各种物质颗粒在 单位强度离心场中沉降速率的量度，称为沉 降系数。沉降系数的单位叫斯维伯格单位 Svedberg unit，简称“S”， 各种细胞亚 微结构和蛋白质颗粒都具有各自固定的S值。 1.差速离心 differential centrifugation 是利用不同离心速度所产生的离心力差 别，可将大小不同的亚微结构颗粒分离 开。此法适用于分离沉降速率差别较大 的亚微结构颗粒，而对于差别较小的则 应采用密度梯度离心法。 2、密度梯度离心 density gradient centrifugation 首先将离心溶液制备成

18、连续或不连续增 高的密度梯度，其密度变化的范围与待 分离颗粒的密度大致相当，然后通过一 段时间离心操作后，不同密度的颗粒就 会分别集中于与其相应的密度梯度区带 之中，而得以分离。 常用的密度梯度离心方法有两种：（1）蔗糖 密度梯度离心。即事先配制一系列不同浓度 的蔗糖溶液，分先后顺序缓缓注入离心管， 制成自下而上递减的浓度梯度（ 5 20% 或 10 60%）。 再将待分离的颗粒混合悬液 加在最上面。然后在离心过程中，这些颗粒 会在蔗糖浓度梯度中徐徐沉降， 当沉降达到 平衡状态时，不同类型的颗粒便会分别集中 在与其对应的浓度区带之中。最后掌握在颗 粒区带抵达管底前停止离心，按区带分别收 集样品

19、，进行分析。 （2）氯化铯密度梯度离心。氯化铯的 密度梯度不需事先制备，而是在离心场 中会自行形成稳定的连续梯度。即在离 心操作前，将待分离的生物大分子悬液 加入氯化铯溶液中。离心时，当氯化铯 形成稳定梯度后，各种生物大分子便会 自动向梯度中相当于本身浮力密度的位 置移动， 最终每种类型的大分子在等 密点形成一条狭窄的带。因此这种方法 又被称为等密度梯度离心。 三、细胞生理测定 （一）细胞膜电位测定 细胞膜内外两侧的阳离子浓度不同，通常是 外高内低（外正内负），造成细胞膜内外具 有一定的电位差，被称为膜电位。膜电位的 变化能反映细生理变化， 譬如当神经兴奋 信号传导时，或肌肉收缩运动时，膜电位

20、都 会发生显著变化。 测量膜电位是采用微电极。微电极是由毛细 玻璃管所构成，管内注满KCl溶液， 插入一 根银丝，银丝用导线与电位计或示波器连接 。测量时使用一对微电极，一个插入细胞内 ，一个插在细胞外的介质中，即可以电位计 或示波器来显示和记录细胞内外的电位变化 。 （二）细胞电泳 cell electrophoresis 细胞表面的分子具有电荷基团，因此在外加 电场作用下，悬液中的细胞都会朝正极泳动 ，这称为细胞电泳。不同类型的细胞，或者 处于不同生理状态下的同种细胞，由于其细 胞表面的电荷量有所不同，所以在同电场中 的电泳速度不同；而在恒定条件下，同种细 胞的电泳速度是相对稳定的。所以细

21、胞电泳 技术对研究细胞癌变有重要作用。此外，细 胞电泳装置还能用来分离不同种类的活细胞 。 四、其它实验技术 （一）细胞培养cell culture 胚胎培养离体组织培养细胞培养， 细胞培养是细胞生物学的基础研究技术，同 时在医学、农业等领域都有广阔的应用价值 。 原理：将生物体的某一类群细胞，甚至单个 细胞分离出来，放入具有适合细胞生活条件 的培养器皿中，维持并促进其正常生长和繁 殖。 技术环节：细胞分离、培养条件和培养基。细 胞分离方式机械分割、酶解处理，动物组 织细胞通常以胰蛋白酶消化细胞间的联结，植 物组织细胞则是以纤维素酶和果胶酶消化细胞 壁等联结物质。细胞培养条件要尽可能与生物 体

22、内生理状况一致，主要是培养温度、pH值和 渗透压等。此外，细胞培养还必须保持严格无 菌，因为离体细胞已脱离了生物体免疫系统的 保护，是极易受细菌、真菌等微生物的污染侵 害。培养基的选择是决定培养成败的技术关键 ，培养基主要成分包括：各种氨基酸、维生素 、碳水化合物、无机盐以及能促进细胞生长分 裂的生长素、细胞激动素等，动物细胞培养基 中还需要增添胎牛血清。 细胞培养方式：培养瓶培养、液体悬浮 培养、平板培养、回转玻璃管培养等。 细胞培养的名词概念： （1）传代：当培养细胞长满一层后， 必须分瓶接种再培养。 该人为操作称 为传代。 （2）原代培养：指从组织中分离出来 ，连续培养十代之内的细胞培养

23、。 （3）继代培养：连续培养十代以后的 操作。 （4）细胞系cell line：从原代培养物 中接种得来的一群不均一的细胞， 可 长期连续传代。 （5）细胞株cell strain： 是从原代培养物或细 胞系中筛选获得的具有某种特殊遗传特性、生 化特性和特异标记的培养细胞群。 细胞系 一般都是转化细胞，可以无限传代，长期繁延 下去（连续细胞系）。而细胞株却与细胞系不 同，其生存期是有限的（有限细胞系）。 细胞（株）系是供细胞遗传学、细胞生理学、 免疫病理学研究的好实验材料。例如 HeLa 细胞系是 1953 年取自一位美国黑人妇女的子 宫颈瘤上皮细胞，现在全世界仍采用该细胞系 做人体细胞生化等

24、研究的典型材料; 此外, 著名的动物细胞试验材料 - CHO 细胞系 （chinese hamster ovary) 是取自中国仓鼠 卵巢组织的细胞系 。 （6）克隆 clone 即无性繁殖系。目前有植物克隆、动物 克隆、微生物克隆、胚胎克隆、细胞克 隆和分子克隆之分。 细胞克隆即指由单个细胞培养繁殖而成 的一群遗传性状完全相同的细胞群体。 如果一个细胞株是通过克隆形成法产生 的， 那么这个细胞株亦可称为一个克 隆。 （二）细胞显微操作技术 运用显微操作器可对细胞进行微量注射、细 胞核移植、膜电位测定、胚胎切割和基因转 移等多种细胞生物学研究工作。 显微操作器的主体部分是倒置显微镜加上显 微操

25、纵仪组成，显微操纵仪是能精密调节的 微动机械装置， 可以在光镜视野下控制微 型解剖针、微电极以及毛细吸管等器械对细 胞进行显微手术，先进的显微操作器还装有 闭路电视、电脑和示波器， 可以边操作，边 监视细胞内的变化情况。我国著名学者童第 周教授1963年就应用显微操作器开展细胞核 移植,研究动物细胞的核质关系。而1997年“ 多莉”克隆羊即是由显微操作进行细胞核移 植的结果。 （三）细胞融合cell fusion 是有广泛实用价值的细胞工程技术。即 以融合因子诱导两个或两个以上的细胞 融合成一体，形成新类型的杂种细胞。 细胞杂交不但可以在不同种或者不同属 生物的细胞之间进行，而且还可以在亲 缘

26、差距极大的细胞之间进行，例如人的 成纤维细胞与小鼠肿瘤细胞杂交，胡萝 卜的原生质体与蟾蜍体细胞杂交等等。 诱导细胞杂交的融合因子： （1）灭活的病毒（例如仙台病毒、新城鸡瘟 病毒、疱疹病毒）； （2）聚乙二醇PEG、溶血卵磷脂； （3）高pH值、高钙离子（植物细胞融合） ；（4）电脉冲细胞融合 细胞融合技术被广泛应用于人类基因定位 研究、细胞分裂周期调控研究及肿瘤免疫学 等研究，例如“单克隆抗体”就是应用细胞 融合技术与免疫学技术巧妙结合的科技产物 。 （四）细胞拆合 应用某些物理方法（例如显微操作核移植和 去核）或化学方法（例如以细胞松弛素B 处 理后离心去核），把细胞拆开成为两部分 核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast ）， 再把来自不同种类细胞的这两部分融合 组成“重组细胞”。可适用于基础理论研究 和应用基础研究。