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1、第八章 非线性色谱原理及其在蛋白质分离与纯化中的应用,1、制备型液相色谱 preparative liquid chromatography,09:50:32,获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。 半制备柱（内径8mm，长度15 30cm），一次制备量.1mg；,2.制备HPLC概述主要结构单元,输液部:输液泵 shimadzu LC-6AD(适用于分析-半制备,再循环半制备) 分离部:制备柱 内径2050mm，柱长50cm。 检测部:检测器 shimadzu SPD-M10Avp 馏分部:馏分收集器 shimadzu FRC-10A,色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量
2、； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大 进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。,制备HPLC概述柱容量,制备HPLC概述制备HPLC与 分析HPL比较,3. 制备型液相色谱仪,09:50:32,制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 制备柱：内径2050mm，柱长50cm。,基本概念,Cs=KCm 线性色谱:流动相中的样品浓度(Cm)与固定相中的样品浓度(Cs)呈线性关系. 非线性色谱:Cm与Cs不存在线性关系的色谱. 分析色谱大多属于线性色谱;制备色谱大多属于非线性
3、色谱,非线性色谱的特点,样品的保留值可变:非线性色谱的保留值随样品及其浓度的不同而变化; 峰形的不对称性:不是高斯正态分布; 色谱峰的峰高与浓度不是线性关系:峰高增加的速率随浓度的增加而下降.,非线性色谱理论基础,研究对象：样品在固定相和流动相中的浓度处于非线性关系下，各种实验参数对色谱分离过程的影响，建立起柱参数、溶质性质及操作条件之间的定量关系。 首先要了解Cs与Cm之间的函数关系，也即要研究吸附等温线及相应的吸附模型,吸附等温线：一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。,分类：凸形、凹形、S形、H形、阶梯形,图8. 分布等温线类型及对色谱峰形和保
4、留时间的影响,通常出现于大多数小分子化合物,它反映了溶质分子在固体表面达到饱和时生成了单分子吸附层，随着溶质浓度的增加，吸附等温线的曲率逐渐减小，最后为零即达到饱和态。,“拖尾”,H型等温线,是凸形等温线的特殊状态，它代表了一类很容易在固体表面吸附的物质，而且很容易达到饱和，这类吸附主要是一些分子量大的聚合物，如聚乙烯、聚苯乙烯,凹形吸附等温线是适用于在低浓度下已吸附的被吸附分子又能吸附在液相中的分子，从而生成多分子吸附层的那些物质，所以这种吸附等温线的曲率随浓度的增加而增加。,S形等温线实际上是凸形与凹形两种等温线叠加的产物，它代表了被吸附的分子之间具有很强的作用力，能进一步吸附其他分子，而
5、溶质分子与固相表面的作用力相对较弱，或者与表面覆盖率无关。,？问题：各种类型等温线代表的溶质在两相间具哪些分配特性？ ？问题：从吸附等温线能提供哪些非线性色谱性质的信息？,吸附等温线可以提供以下信息： 预测代表该吸附等温线的组分在非线性色谱中色谱峰的形状； 为非线性色谱分离与纯化物质选择最佳条件； 反映被分离物质分子与固定相表面的作用，从而研究分子的构型及吸附状态。 建立分子结构-吸附之间的定量关系，从而由分子结构预测吸附性能。,吸附等温线的测定 A、静态测量法 q与C之间的关系（q：溶质在吸附剂上的浓度；C：溶液浓度）： q=C.V/G （V为溶液体积，G为吸附剂量） 优点：方便简单，不需要
6、特殊的仪器 缺点：测量缓慢，平衡时间长，平衡点不容易判断，数据不易测准，对比较昂贵的生物样品不合适。,B、动态法 常用的有4种方法: 前沿分析法(FA) 特征点前沿分析(FACP) 特征点洗脱(ECP) 平台洗脱(EP),非线性色谱基本理论（P146147） 吸附平衡热力学； 吸附平衡动力学; 色谱基本物料平衡方程。,色谱基本物料平衡方程可以解释为何不同的吸附等温线会产生不同形状的非线性色谱峰,非线性色谱固定相,非线性色谱中粗和细的颗粒都在使用，原则上细颗粒填料的柱效高，价格比较贵。粗颗粒填料柱效低，但价格便宜，而且柱压低适合制备柱。 从材料看目前有：硅胶类和有机树脂类。 孔径大小：对不同生物
7、大分子分离有各自不同的合适孔径大小,色谱柱及填充技术,最长柱长！原因： 超过-无法得到均匀填充床； 柱效不是与柱长永远成比例增长； 高压泵的容量的限制。,色谱柱及填充技术,填充方式： 干法：适用于直径30um的颗粒； 湿法：适用于直径20um的颗粒。,在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。,为防止出现死空间而降低柱效，可对制备柱采用压缩技术,样品溶解与进样技术,增加溶质的溶解度： 溶剂的性质必须适应于所用的固定相；,使大量的样品溶液导入色谱柱后不马上扩散,在反相色谱中，溶解样品的溶剂极性必须大,吸附色谱中恰恰相反，溶剂的极性必须小于
8、流动相,疏水作用色谱中，溶剂的离子强度不能小于流动相的离子强度,进样：必须保证大量样品溶液能均匀分布在柱的截面上，使轴向扩散及局部超载降至最低。,（1）采用带样品管的六通进样阀；（2）用高压泵直接输送样品,非线性色谱的3种展开方式,1.超载洗脱：与传统的洗脱方法差别不大。但样品在固定相上的负载超过了线性洗脱色谱的容量，展开时浓度逐渐稀释，形成较宽而平坦的峰。 优点：产率高，省时，节省溶剂 缺点：柱效不如线性洗脱高，溶剂不断稀释，后期纯化麻烦。,非线性色谱的3种展开方式,2.前沿分析：样品溶液不是作为一部分进入色谱柱，而是连续不断地输入色谱柱，即它本身起了流动相的作用。洗脱展开峰是以一个个台阶的方式展示的。,适合浓缩痕量组分; 适合产品精制,除去痕量组分; 不会被稀释,非线性色谱的3种展开方式,3.置换展开：在样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的流动相通入色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。 优点：溶质浓度不降低，还可以起浓缩作用。 缺点：置换剂不好找；合适的固定相和流动相的取得不容易。,