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1、犬小孢子菌SSH文库中差异基因的研究,硕士研究生：张渊 指 导 教 师：杨国玲 教授 专 业 名 称：皮肤病与性病,前 言,犬小孢子菌主要侵犯儿童 引起白癣、脓癣和体癣 儿童头癣48%,儿童体癣36% 成人头体癣16%,研究背景,1.儿童皮脂腺发育不完全 2.犬小孢子菌蛋白酶的作用,犬小孢子 菌儿童头癣 发病机制,推测儿童头皮是否诱导 犬小孢子菌毒力因子,？,材 料,前期试验克隆：菌液PCR，菌液克隆 主要试剂： 1. DIG High Prime Labeling&Detection Starter Kit I 2. 杂交膜 3. Real time PCR Kit 主要仪器： 1. CL1
2、000紫外交联仪（UVP） 2. Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System,儿童头皮 培养菌株 (tester),儿童光滑皮肤 培养菌株 (driver1),成人头皮组织 培养菌株 (driver2),斑点杂交 实时PCR,技术路线,获得差 异基因,前期完成试验,消 减 文 库,SSH,方法-斑点杂交,正反向 消减文库 PCR扩增,制备探针,酶切回收,杂交膜,DIG-High Primer,探针,菌液PCR产物,阳性克隆测序,阳性克隆菌液送大连宝生物测序：菌种为DH10B，载体为PMD-T18 测序使用引物为：F Primer（M13-47）；R
3、 Primer（RV-M）,测序分析,序列预处理,去除混杂基因,同源性比对,功能分类,实时PCR,Tester mRNA,Driver1 mRNA,Driver2 mRNA,2个 基因,2个 基因,18S rRNA,3个RNA池均为构建消减文库时保存的总RNA,探针引物序列,结 果消减文库酶切前后结果,结 果-斑点杂交,消减文库1斑点杂交部分结果,正向 反向,正向,反向,消减文库2斑点杂交部分结果,结 果-斑点杂交,阳性克隆测序及分析,共得到106个有效序列,共得到13个ESTs,8个ESTs找到了同源基因,6个同源基因具有功能分类,消减文库1差异基因比对结果,消减文库2差异基因比对结果,蛋白
4、功能分类,实时PCR-18s rRNA,18s rRNA基因在3个RNA池中的实时PCR表达情况,FSH1基因在tester RNA池和driver 1 RNA池中的实时PCR表达情况,实时PCR- FSH1,PQ-LRP基因在tester RNA和driver 1 RNA池中的实时PCR表达情况,实时PCR- PQ-LRP,P-GAL4基因在tester RNA池和driver 2 RNA池中的实时PCR表达情况,实时PCR- P-GAL4,NADH1基因在tester RNA池和driver 2 RNA池中的实时PCR表达情况,实时PCR- NADH1,4个ESTs表达的相对表达倍数关系,
5、讨 论,犬小孢子菌 致病因子表达,犬小孢子菌 主要致儿童头癣,儿童头皮组织 结构蛋白差异,利用SSH,可能影响,讨 论,Tester和driver作为探针,低丰度基因的丢失,正反向消减DNA作为探针,避免低丰度基因的丢失 高背景，阳性率降低,去掉接头,降低背景，筛选差异基因,讨 论,儿童头皮培养菌株,儿童光滑皮肤培养菌株,构建文库 富集差异基因,成人头皮培养菌株,讨 论,讨 论-FSH1,目前对FSH1的研究主要是对其结构的分析 FSH1是酯酶，水解疏水磷酸酯、油酯化合物 FSH家族功能较多：蛋白酶作用 、调控因子作用等 FSH1在此发挥蛋白酶作用还是调控因子作用还不清楚,Sophie Que
6、villpn-cheruel,讨 论-PQ-LRP,PQ-LRP蛋白是膜绑定蛋白，拥有一对重复的环结构 （环1和环2） 环2对半胱氨酸载体定位于溶酶体至关重要 半胱氨酸载体调控半胱氨酸代谢 PQ-LRP基因的上调表达，可能与半胱氨酸的代谢增强有关 PQ-LRP基因可能是犬小孢子菌的重要致病因子,讨 论-NADH1,NADH1是呼吸链的组成部分，参与ATP的生成 犬小孢子菌ATP利用率的增加，可能与其在儿童头皮组织中生长更活跃有关,讨 论-P-GAL4,P-GAL4基因属于GAL4家族，含有一个真菌中独有的GAL4域 GAL4家族普遍的功能是转录调节，主要调控氮源代谢、生殖繁殖等 在本研究中，P
7、-GAL4基因在此可能是调控真菌的生殖，导致犬小孢子菌在儿童的头皮组织中大量繁殖 ，导致头癣的发生,结 论,SSH1文库得到5个差异基因： 1. FSH1 2. PQ-LRP 3. multidrug resistance protein MDR 4. RING zinc finger protein 5. RING zinc finger protein, putative,结 论,SSH2文库3个差异基因： 1. P-GAL4 2. NADH1 3. DNA-directed RNA polymerase I subunit,结 论,FSH1和PQ-LRP基因可能在犬小孢子菌致头癣的发病机制中起重要作用 P-GAL4和NADH1基因可以作为研究犬小孢子菌致头癣的候选基因,导师杨国玲教授 张振颖老师 大连理工大学金礼吉教授 师姐张芙蓉 全体皮肤科老师,致 谢,