生化chapter 03-07 amino acids and proteins-1.ppt

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1、第三章 氨基酸与蛋白质,教材 第3-7章 What is the structure, chemistry, and biological function of amino acids， peptides， proteins?,概念 分类 功能,第一章氨基酸的结构和性质,1、一般结构,2、分类,常用方法：硫酸或盐酸处理 浓度:盐酸为6mol/L 硫酸为4mol/L 条件:回流煮沸20 h左右 优点:不引起消旋作用，得到L-氨基酸 缺点:色氨酸完全被沸酸所破坏 羟基氨基酸（丝,苏）部分被水解 天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来,（酸水解）,1.1 蛋白质的水解,常用方法：用氢氧化钠处理 浓度

2、: 5mol/L 条件:共煮1020 h 优点:色氨酸稳定 缺点:多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生 消旋现象；所得为D型和L型混合氨基酸； 碱水解引起精氨酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素,（碱水解）,1.1 蛋白质的水解,优点:不产生消旋作用，也不破坏氨基酸 缺点:需要几种酶协同作用， 酶水解所需时间较长,（酶水解）,1.1 蛋白质的水解,水解位点,R1：赖氨酸（Lys） 精氨酸（Arg） 特点：专一性较强，水解速度快,N,H,C,H,C,O,R,4,N,H,C,H,C,O,R,3,N,H,C,H,C,O,R,2,N,H,C,H,C,O,R,1,OH,（牛胰蛋白酶）,1.1 蛋白质的水解,N,H

3、,C,H,C,O,R,4,N,H,C,H,C,O,R,3,N,H,C,H,C,O,R,2,N,H,C,H,C,O,R,1,水解位点,R1：苯丙氨酸(Phe) 色氨酸（Trp） 酪氨酸(Tyr) 亮氨酸(Leu) 疏水氨基酸 特点：水解稍慢,OH,糜蛋白酶,1.1 蛋白质的水解,N,H,C,H,C,O,R,4,N,H,C,H,C,O,R,3,N,H,C,H,C,O,R,2,N,H,C,H,C,O,R,1,水解位点,R1：苯丙氨酸(Phe) 色氨酸(Trp） 酪氨酸(Tyr) 亮氨酸(Leu) R2: 疏水氨基酸 特点：水解速度较快，作用条件与糜蛋白酶不同,OH,胃蛋白酶,1.1 蛋白质的水解,1

4、.2 蛋白质的基本结构单元,除了甘氨酸以外，组成蛋白质的所有氨基酸都有手性碳原子。,1.2 蛋白质的基本结构单元,组成蛋白质的氨基酸以肽键的形式链接在一起。,L氨基酸,D氨基酸,组成蛋白质的氨基酸大都为L型,氨基酸的构型,1.2 蛋白质的基本结构单元,2.1 氨基酸的分类（名称，缩写，结构式）,按侧链R基的化学结构特点 脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸、杂环氨基酸 根据R基团的极性 非极性R基、极性R基氨基酸（不带电荷的、带正电荷的、带负电荷的） 根据酸碱性质 酸性氨基酸、碱性氨基酸、中性氨基酸 按氨基酸是否能在人体内合成 必需氨基酸、半、非必需氨基酸,2.1 氨基酸的分类,2.1 氨基酸的分类,（

5、其他教材，仅供参考）,一氨基一羧基氨基酸有甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸 含羟基氨基酸有丝氨酸、苏氨酸 含硫氨基酸有半胱氨酸、蛋氨酸（常称甲硫氨酸） 一氨基二羧基氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸 二氨基一羧基氨基酸有赖氨酸、精氨酸 含酰胺基氨基酸有天冬酰胺、谷氨酰胺,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,一氨基一羧基氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,一氨基一羧基氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,一氨基一羧基氨基酸3,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,一氨基一羧基氨基酸4,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,一

6、氨基一羧基氨基酸5,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,含羟基氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,含羟基氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,含硫氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,2个半胱氨酸通过二硫键连接形成胱氨酸,含硫氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,含硫氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,一氨基二羧基氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,一氨基二羧基氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,二氨基一羧基氨基酸1,（1）按侧链R基的

7、化学结构特点 -脂肪族氨基酸,二氨基一羧基氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,含酰胺基氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,含酰胺基氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点 -脂肪族氨基酸,芳香族氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点 -芳香族氨基酸,芳香族氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点 -芳香族氨基酸,芳香族氨基酸3,（1）按侧链R基的化学结构特点 -芳香族氨基酸,杂环族氨基酸1,（1）按侧链R基的化学结构特点 -杂环氨基酸,亚氨基酸,杂环族氨基酸2,（1）按侧链R基的化学结构特点 -杂环氨基酸,（2）根据R基团的极性,非极性R基氨基酸：

8、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和脯氨酸等8种 极性但不带电荷的R基氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺等7种 带负电荷的R基氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸 带正电荷的R基氨基酸：赖氨酸、精氨酸和组氨酸3种,非极性R基氨基酸,（2）根据R基团的极性,极性但不带电荷的R基氨基酸,（2）根据R基团的极性,带负电荷的R基氨基酸,（2）根据R基团的极性,带正电荷的R基氨基酸,（2）根据R基团的极性,（3）根据酸碱性质,酸性氨基酸 一氨基二羧基氨基酸，有天冬氨酸、谷氨酸 碱性氨基酸 二氨基一羧基氨基酸，有赖氨酸、精氨酸、组氨酸 中性氨基酸 一氨基一羧基

9、氨基酸，除上述酸性和碱性氨基酸外，其余15种氨基酸都属于中性氨基酸,（4）按氨基酸是否能在人体内合成,必需氨基酸 指人体内不能合成的氨基酸，必须从食物中摄取，有8种：赖氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸 半必需氨基酸 指人体内可以合成但合成量不能满足人体需要（如发生代谢障碍、婴幼儿生长时期）的氨基酸，有2种：组氨酸、精氨酸 非必需氨基酸 指人体内可以合成的氨基酸。包括除了上述必需和半必需氨基酸外，其余的10种氨基酸,-丙氨酸,-氨基丁酸,H2N-CH2-CH2-COOH,H2N-CH2-CH2-CH2-COOH,2.2 不常见的蛋白质氨基酸与非蛋白质氨基酸,甲状

10、腺氨酸,氨基脂肪酸,焦谷氨酸,肌氨酸,甜菜碱,重氮丝氨酸,高(同型)丝氨酸,羊毛硫氨酸,氯霉素,环丝氨酸,肾上腺素,含于血液中的复合胺,青霉胺,3.1 氨基酸的一般物理性质,形状和味感 -氨基酸都是白色晶体，各种氨基酸结晶形状不同，滋味不同 溶解性和熔点 除胱氨酸和酪氨酸外，氨基酸一般都能溶于水中，但各种氨基酸在水中的溶解度差别很大。除脯氨酸和羟脯氨酸能溶于乙醇或乙醚中以外，所有氨基酸易溶于稀酸或稀碱溶液中。氨基酸的熔点很高，一般在200以上 旋光性 除甘氨酸外，所有天然氨基酸含有至少一个手性-碳原子，因此都具有旋光性,光吸收性 在可见光区域，20多种氨基酸都没有光吸收，但在红外区和远紫外区域

11、（220 nm）均有光吸收。由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸分子中R基含有苯环共轭键系统，故在近紫外区显示特征性的吸收谱带，酪氨酸的max275nm，苯丙氨酸的max257nm，色氨酸的max280nm，以色氨酸吸收最强。 可利用此性质采用紫外分分光度法测定蛋白质的含量。,3.1 氨基酸的一般物理性质,3.2 氨基酸的酸碱性质,氨基酸的两性解离 氨基酸的等电点 氨基酸的甲醛滴定,3.2.1 氨基酸的两性解离,氨基酸分子中既含有氨基又含有羧基，在晶体状态或在水溶液中主要是以兼性离子的形式存在：,兼性离子亦称偶极离子，是指在同一氨基酸分子上带有能放出质子的-NH3+正离子和能接受质子的-COO负离子，

12、是两性离子,加酸时,H+,H+,总电荷 “+”,3.2.1 氨基酸的两性解离,加碱时,总电荷 “”,OH,OH,3.2.1 氨基酸的两性解离,完全质子化的氨基酸可以看成是多元酸，侧链不能解离的中性氨基酸可看作是二元酸,它的分步解离如下：,3.2.1 氨基酸的两性解离,其中K1和K2分别代表第一步解离（-碳原子上-COOH的解离）和第二步解离（-碳原子上-NH3+的解离）的（表观）解离常数。其数值为 K1 = Ao H+/ A+ K2 = A- H+/ Ao,3.2.1 氨基酸的两性解离,通过测定滴定曲线可以求得氨基酸的解离常数,C,O,O,C,H+H+,H,3,N,+,H,C,O,O,H,C,

13、H,H,3,N,+,H,C,O,O,C,H+H+,H,2,N,H,K2,Gly +,Gly ,Gly ,K1=AOH+/ A + K2=AH+/ AO,3.2.1 氨基酸的两性解离,pH = pK + log,质子受体,质子供体,通过氨基酸的滴定曲线，当已知pK1和 pK2等数据时，可用下列Handerson-Hasselbalch公式求出在任一pH条件下一种氨基酸溶液中各种离子所占的比例,3.2.1 氨基酸的两性解离,当溶液为某一pH值，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等时(净电荷为0),这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即

14、氨基酸处于两性离子状态,3.2.2 氨基酸的等电点,C,O,O,C,H,H,3,N,+,R,C,O,O,C,H,H,2,N,R,在酸性溶液中 （pH pI）,在晶体状态或水溶液中 （pH=pI）,在碱性溶液中 （pHpI）,3.2.2 氨基酸的等电点,丙氨酸pI的计算,C,O,O,C,H+H+,H,3,N,+,CH3,C,O,O,C,H,H,2,N,CH3,Ala+,Ala ,Ala,K1=AlaH+/ Ala+ Ala+= AlaH+/ K1 K2=AlaH+/ Ala Ala=Ala K2/ H+ 到达等电点时， Ala+= Ala Ala H +/ K1 = Ala K2/ H +，即：

15、 K1 K2 = H +2 两边取负对数：lg H +2= lg K1lg K2 lg H + =pH lg K1 = pK1 lg K1 = pK2 2pH = pK1 pK2 令pI为等电点时的pH， 则： pI （pK1 pK2）/2,+H+,3.2.2 氨基酸的等电点,天冬氨酸pI的计算,Asp+,Asp ,Asp ,C,O,O,C,H,H,3,N,+,CH2,C,O,O,H,C,O,O,C,H,CH2,Asp =,C,O,O,C,H,H,2,N,CH2,C,O,O,等电点时为Asp pI （pK1 pKR）/2,H,3,N,+,3.2.2 氨基酸的等电点,赖氨酸pI的计算,Lys+

16、+,Lys +,Lys ,C,O,O,H,C,H,H,3,N,+,(CH2)4,NH3+,C,O,O,C,H,H,3,N,+,(CH2)4,NH3+,C,O,O,C,H,H,2,N,(CH2)4,NH3+,K1,K2,KR,Lys ,C,O,O,C,H,H,2,N,CH2,NH2,等电点时为Lys pI （pK2 pKR）/2,3.2.2 氨基酸的等电点,pI = (pK1+pKR)/2,pI = (pKR+pK2)/2,侧链不含解离基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI = (pK1 + pK2 )/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子

17、两边的pK值的算术平均值 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR)/2 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR)/2,3.2.2 氨基酸的等电点,氨基酸不能直接用酸、碱滴定定量测定 其原因是氨基酸的酸、碱滴定终点时pH过高（1213）或过低（12），超出酸碱滴定指示剂的显色范围 若向氨基酸溶液中加入过量的甲醛，由于甲醛与氨基酸中的氨基（-NH2）反应生成羟甲基化合物而降低氨基的碱性，反应向右进行，促进了氨基酸-NH3+的酸性解离，释放出H，使反应的终点pH从1213下降至9附近，可以用酚酞作指示剂用标准NaOH溶液加以滴定这就是氨基酸的甲醛滴定法,3.2.3 氨基酸的甲醛滴定,甲醛反应

18、,R,CH,NH3+,COO,HCHO,R,CH,NHCH2OH,HCHO,R,CH,N(CH2OH)2,羟甲基氨基酸,二羟甲基氨基酸,COO,COO,3.2.3 氨基酸的甲醛滴定,-氨基参加的反应 -羧基参加的反应 -氨基和-羧基共同参加的反应 侧链R基参加的反应,4 氨基酸的常见化学反应,巯基反应 颜色反应,茚三酮的反应 成肽反应,与亚硝酸 酰基化 烃基化 形成西佛碱 脱氨基和转氨基,成盐和成酯 成酰氯 叠氮 脱羧,4 氨基酸的常见化学反应,4.1 -氨基参加的反应,与亚硝酸反应 酰基化反应 烃基化反应 形成西佛碱反应 脱氨基和转氨基反应,4.1.1 与亚硝酸反应,原理：自由氨基能与亚硝酸

19、反应释放出氮气，每克分子的自由氨基可生成一克分子氮气 在生产上常用此法来测定蛋白质的水解程度,R,CH,COOH,NH2,+ HNO2,R,CH,COOH,OH,+ N2,+ H2O,4.1.2 酰基化反应,氨基酸的氨基可与酰化试剂，如酰氯或酸酐在碱性溶液中反应生成酰胺 该反应在多肽和蛋白质的人工合成中可用于保护氨基 常用的酰化试剂包括苄氧甲酰氯、对甲苯磺酰氯、叔丁氧甲酰氯、邻苯二甲酸酐、丹磺酰氯等,5-二甲氨基萘磺酰氯（丹磺酰氯）。它具有强烈的荧光，可用荧光光度计快速检出，灵敏度高,4.1.2 酰基化反应,丹磺酰氯反应,4.1.2 酰基化反应,4.1.3 烃基化反应,氨基酸氨基的一个氢原子可

20、被烃基（包括环烃及其衍生物）取代 例如在弱碱性溶液中，氨基酸的-氨基很容易与2,4-二硝基氟苯作用，生成稳定的黄色2，4-二硝基苯基氨基酸,AA DNFB+多肽 蛋白,+ HF,DNP- AA DNP-多肽 DNP-蛋白,原理：在弱碱性溶液中，氨基酸的-氨基很容易与DNFB作用，生成稳定的黄色DNP-氨基酸（ 2，4一二硝基苯氨基酸）,多肽或蛋白质N-末端氨基酸的-氨基也能与DNFB反应 用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸,亦称Sanger反应,4.1.3 烃基化反应,R,CH,NH2,+ HF,+,NO2,F,COOH,R,CH,N,COOH,H,pH89,NO2,DNP-氨基酸

21、,4.1.3 烃基化反应,用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸,亦称Edman反应,弱碱,AA PITC+ 多肽 蛋白,AA PTC多肽 蛋白,HF,PTH-AA + 少一个AA的多肽或蛋白,苯异硫氰酸酯,苯氨基硫甲酰-,苯乙内酰硫脲,4.1.3 烃基化反应,苯异硫氰酸酯,苯氨基硫甲酰-,苯乙内酰硫脲,4.1.3 烃基化反应,4.1.4 形成西佛碱反应,氨基酸的-氨基与醛类化合物反应，生成称为西佛碱的弱碱 赖氨酸的侧链氨基也能发生该反应,4.1.5 脱氨基和转氨基反应,氨基酸在氧化剂或酶（如氨基酸氧化酶）的催化作用下可脱去-氨基，转变成相应的-酮酸 是生物体内氨基酸分解代谢的重要方式

22、之一,4.2 -羧基参加的反应,成盐和成酯反应 成酰氯反应 叠氮反应 脱羧反应,4.2.1 成盐和成酯反应,氨基酸与碱作用即生成盐，其中重金属盐不溶于水 氨基酸的羧基可与醇反应，生成相应的酯,4.2.2 成酰氯反应,将氨基酸的氨基用适当的保护基（如苄氧甲酰基）保护以后，其羧基可与五氯化磷或二氯亚砜作用生成酰氯 该反应使氨基酸的羧基活化，使之易与另一氨基酸的氨基结合，因此常用于多肽的人工合成,4.2.3 叠氮反应,YNH,CH,COOH,R,NH2NH2,+2H2O,YNH,CH,CO NH NH,R,HNO2,YNH,CH,CON3,R,用途：可活化羧基，常用于人工合成肽过程,酰化氨基酸,酰化

23、氨基酸的肼衍生物,酰化氨基酸叠氮,4.2.4 脱羧反应,在氨基酸脱羧酶的催化下，生物体内的氨基酸可脱去羧基，放出二氧化碳并生成相应的一级胺。,肉类腐败,4.3 -氨基和-羧基共同参加的反应,与水合茚三酮反应 成肽反应,用途：常用于氨基酸的定性或定量分析,4.3.1 与水合茚三酮反应,脯氨酸及羟脯氨酸与茚三酮反应产物 黄色化合物,N+,4.3.1 与水合茚三酮反应,一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而成的化合物叫肽，形成的键叫肽键，又称为酰胺键，写作-CO-NH- 在蛋白质分子中，氨基酸借肽键连接起来，形成肽链。,4.3.2 成肽反应,4.4 侧链R基 参加的反应,半胱氨酸侧链上巯

24、基参与的反应 侧链R基参加的重要颜色反应,4.4.1 半胱氨酸侧链上巯基参与的反应,与卤化烷（如碘乙酸、碘乙酰胺、甲基碘等）迅速反应，生成相应的稳定烷基衍生物 可用于巯基的保护，应用在肽合成工作中,半胱氨酸的巯基能打开乙撑亚胺（又称氮丙啶）的环，生成S-氨乙基半胱氨酸（AECys）。 可用于巯基的保护。,4.4.1 半胱氨酸侧链上巯基参与的反应,巯基很容易受空气或其它氧化剂氧化，一种是半胱氨酸氧化形成二硫键。（disulfide bond），生成胱氨酸，-SH与-S-S-自成一氧化还原体系，在机体氧化还原作用中起一定作用。,4.4.1 半胱氨酸侧链上巯基参与的反应,二硫键：是由二个半胱氨酸残基

25、的侧链之间形成的。即胱氨酸的残基中的二硫键。 二硫键类型：可以使两条单独的肽链共价交联起来（链间二硫键）；也可以使一条链的某一部分形成环（链内二硫键）。,4.4.2 侧链R基参加的重要颜色反应,米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液；当蛋白溶液中加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色；由于酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故有此反应。 Tyr中的酚基能将Folin试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物），利用该反应，可以检测Tyr或含Tyr的蛋白质。 芳香族氨基酸，特别是Tyr、Trp或含Tyr、Trp的蛋白质在溶液中遇到硝酸后，先产生白色沉淀，加热则

26、变黄，再加碱颜色加深为橙黄色。这是因为苯环被硝化，产生了硝基苯衍生物。皮肤、毛发、指甲遇浓硝酸都会变黄。,坂口反应:Arg的胍基能与次氯酸钠（或次溴酸钠）及-萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色物质，可用来鉴定含有Arg的蛋白质，也可用来定量测定Arg的含量。 乙醛酸反应 凡含有吲哚基的化合物都有乙醛酸反应，由于Trp含有类似结构，因此Trp或含Trp的蛋白质都有此反应。在Trp或含Trp的蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环。,4.4.2 侧链R基参加的重要颜色反应,5 氨基酸的光学特性,Lined up by similarity: chiral to chiral, COO to CHO,Rules for description of chiral centers in the (R,S) system,6 氨基酸的分离纯化结构鉴定,