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1、,超速离心分离血浆脂蛋白(LDL),生科院生化教研室,教师：李毅,实验目的： 通过超速离心分离血浆脂蛋白能够达到下列要求： 掌握超速离心技术的原理。 熟悉差速沉降离心法 、 密度梯度区带离心法中的差速区带离心法 和等密度区带离心法的机理、特点及应用。 了解制备性离心机分为哪几类、各自的特点及应用。 了解转头、离心管有哪些？各自的特点及应用。 了解梯度材料的选择原则及应用范围 掌握血浆脂蛋白的分离方法。,超速离心分离血浆脂蛋白,实验原理: 本实验采用正常人抗凝血浆，以NaBr为密度介质，利用各脂蛋白颗粒密度不同，经过超速离心大量制备低密度血浆脂蛋白。,离心分离技术 生物样品悬浮液在高速旋转下，由
2、于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。 这项技术应用很广，诸如分离出化学反应后的沉淀物、天然的生物大分子、无机物、有机物。在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。,1.基本原理 离心力：当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即： F = ma = m2 r a 粒子旋转的加速度， m 沉降粒子的有效质 粒子旋转的角速度， r粒子的旋转半径( cm )。,相对离心力：常用地球引力的倍数来表示，因而称为 相对离心力
3、, RCF = ma/ mg= a/ g RCF = = 1.119105(rpm)2 r ( rpm 每分钟转数，r/min ) 由上可见，给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。 若RCF值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。,已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500g即是RCF值。 RCF(g)=1.11910-5rrpm2。,2 离心分类,根据离心原理大致可分三类。 差速离心法 密度梯度离心 1）速率区带离心法 2）等密度离心法,沉降速度: 沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。 沉降
4、时间:在实际工作中，常常遇到要求在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来的问题，这就必须首先知道用多大转速与多长时间可达到目的。如果转速已知，则需解决沉降时间来确定分离某粒子所需的时间。,沉降系数:根据1924年Svedberg对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。 S = （1/2X）（dx/dt）= d2（p-m）/18 1S=10-13秒 式中,d为球形粒子直径；为流体介质的粘度； p为粒子的密度； m为介质的密度。 从该式中可看出， （1）当p m，则SO，粒子顺着离心方向沉降。 （2）当p =m ，则S= 0，粒子到达某一位置后达到平衡。 （3）当p m
5、 ，则SO，粒子逆着离心方向上浮。,2.1差速沉降离心法,采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。,2.2密度梯度区带离心法 ：,区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。 密度梯度区带离心法又可分为两种： 差速区带离心法 等密度区带离心法,2.2.1差速区带离心法： 不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速
6、度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。 此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。,离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大 但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即Pm。,2.2.2等密度离心: 离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。 此密度梯度包含了被分离
7、样品中所有粒子的密度。 当管底介质的密度大于粒子的密度，即mP时粒子上浮；在管顶处Pm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即Pm，此时dr/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带。 定义：离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带。,此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用的梯度液是CsCl。 提高转速可缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。,四种血浆脂蛋白的比重：,此次是将血浆预先与梯度介质混合后装入离心管，通过离心将整个液体形成梯度,在强大离
8、心力作用下各脂蛋白依其自身密度不同而分散于相应的离心管中的密度梯度同一密度层，从而达到分离纯化的目的。,操作步骤 1血浆准备：取血库血浆250mL 。 2CM和VLDL分离： 1）取约250ml血浆调密度至 1.019g/mL，分置于离心管中，加盖，用密度1.019g/mL液平衡，放入RP50T转头，在8下40000rpm，离心时间20小时， CM和VLDL浮于离心管上层，用吸管小心吸取。,3LDL分离： 下层溶液加入适量的NaBr，调节密度至1.063g/mL，分置于离心管中，加盖，用密度1.063g/mL液平衡，放入RP50T转头，在8下40000rpm，离心时间20小时， 浮于离心管上层
9、，用吸管小心吸取。,实验器材: 1.超速离心机：转速5000080000rpm，RCF可达600000g；离心容量由几十ml至2L，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，可进行亚细胞器分级分离，病毒、核酸、蛋白质和多糖等生物大分子的分离。,2.角式转头：离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块完整的金属制成的，其上有412个装离心管用的孔，孔的中心轴与旋转轴间有2040夹角，角度越大沉降越结实，分离效果越好。,角转头的优点：容量较大、重心低、运转平衡、寿命较长。是各种离心机的最高速转头。 缺点：由于颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管，然后沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积而产
10、生“壁效应”，壁效应易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱而影响分离效果。,3. 离心管: 主要用塑料和不锈钢制成 塑料离心管的优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。 管盖有三种作用： 防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。 防止样品挥发。 支持离心管，防止离心管变形。,4.梯度材料: 卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。,超速离心机使用注意事项： 1 超速离心机由专人保管专人使用，非保管人
11、员， 严禁擅自 操作。 2 离心管要对称同量、同液、满管放置，严禁半管和空管 运转。 3 送样人要向操作者说明所离心的溶液是何种溶液，操作 者要作详细记录。 4 运行前首先要平衡转头所需温度，致冷或保温。 5 转头放置要规范、轻放，放好后轻转转头，有速度显 示才可正式运转。 6 关、开离心机的门要轻，防止仪器移位，影响水平。 7 离心后将离心管、转头、腔体擦洗干净，规范存放。,作业 1. 简述离心分离血浆脂蛋白的主要方法。 2. 什么是离心力? 什么是相对离心力?各用什么表示?如何转换？ 3. 制备性离心机可分为几类,叙述每类的特点及应用。 4. 转头可分为几类,每类的特点及应用。 5. 离心管可分为几类,每类的特点及应用。 6. 何谓差速沉降离心法、差速区带离心法、等密度区带离心法，各自的原理是什么? 适用于那些物质的离心? 7. 离心技术中用于调节溶液密度梯度的材料有哪些?各有何特点？ 8. 离心操作的注意事项有那些?（普通、高速、超速）,