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1、蛋白质化学,第 2章,Structure and Function of Protein,下午1时47分,2,Protein 来自希腊字母，意思是“头等重要的，原始的” 蛋白质 来源于对蛋清（清蛋白）的研究,分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,下午1时47分,3,下午1时47分,4,下午1时47分,5,下午1时47分,6,1833年 Payen和Persoz分离出淀粉酶。 1864年 Hoppe-Seyler从血液分离出血红蛋白，并将其制成结晶。 19世纪末
2、 Fischer证明蛋白质是由氨基酸组成的，并将氨基酸合成了多种短肽 。 1938年 德国化学家Gerardus J. Mulder引用“Protein” 一词来描述蛋白质。,大事记：,下午1时47分,7,1951年 Pauling采用X（射）线晶体衍射发现了蛋白质的二级结构-螺旋(-helix)。 1953年 Frederick Sanger完成胰岛素一级序列测定。 1962年 John Kendrew 和 Max Perutz确定了血红蛋白的四级结构。 1965年 我国完成结晶牛胰岛素的人工合成。 20世纪90年代以后 蛋白质组学,下午1时47分,8,生命的起源必然是通过化学途经实现的，只
3、要把蛋白质的化学成份弄清楚以后，化学就能着手制造出活的蛋白质来，如果化学有一天能用人工的方法制造蛋白质，那么这样的蛋白质就一定会显示出生命现象。 反杜林论 恩格斯,下午1时47分,9,什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,下午1时47分,10, 组成蛋白质的元素,有些蛋白质还含有少量的P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se、I等。,C 50 55 % H 6 7 % O 19 24 % N 13 19 % S 0 4 %,主要元素组成,下午1时47分,11,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16
4、。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数 6.25100,1/16%, 蛋白质元素组成的特点,凯氏定氮法：,下午1时47分,12,2.1蛋白质的分类,2.1.1 根据蛋白质形状,膜蛋白质,下午1时47分,13,下午1时47分,14,下午1时47分,15,下午1时47分,16,下午1时47分,17,下午1时47分,18,下午1时47分,19,下午1时47分,20,2.1.2 根据蛋白质组成成分,下午1时47分,21,1.简单蛋白：又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只
5、含由-氨基 酸组成的肽链，不含其它成分。 （1）清蛋白和球蛋白：广泛存在于动物组织中，易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。 （2）谷蛋白和醇溶谷蛋白：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。 （3）精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。 （4）硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。,下午1时47分,22,2.结合蛋白：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成 （1）色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞 色素等。 （2）糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。 （3）脂蛋白
6、：由简单蛋白与脂类结合而成。 如血清-、-脂蛋白等。 （4）核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。 （5）磷蛋白：由简单蛋白质和磷酸组成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。,下午1时47分,23,2.1.3 根据功能分类,1.酶 如蛋白酶 2.调节蛋白 如激素 3.贮存蛋白质 如卵清蛋白 4.转运蛋白 如血红蛋白 5.运动蛋白 如肌球蛋白、肌动蛋白 6.防御蛋白和毒蛋白,下午1时47分,24,7.受体蛋白 8.支架蛋白 9.结构蛋白 10异常蛋白,下午1时47分,25,1）酶的生物催化作用,蛋白质具有重要的生物学功能,下午1时47分,26,2）调控作用,参
7、与基因调控：组蛋白、非组蛋白等 参与代谢调控：如激素或生长因子等,下午1时47分,27,3）运动与支持,机体的结构蛋白：头发、骨骼、牙齿、肌肉等,下午1时47分,28,4）参与运输贮存的作用,血红蛋白 运输氧 铜蓝蛋白 运输铜 铁蛋白 贮存铁,下午1时47分,29,5）免疫保护作用,抗原抗体反应 凝血机制,下午1时47分,30,6）参与细胞间信息传递,信号传导中的受体、信息分子等,7） 氧化供能,下午1时47分,31,2.2 蛋白质的组成单位 氨基酸,下午1时47分,32,氨基酸 组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的基本氨基酸仅有20种,即含有氨基又有羧基
8、的化合物,下午1时47分,33,分子中同时含有羧基和氨基，且与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸。 除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都为不对称碳原子, A. 氨基酸都具有旋光性； B. 每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。,下午1时47分,34,R,下午1时47分,35,既有氨基，又有羧基的小分子有机物称为氨基酸。 氨基酸就是氨基连接在羧酸的碳原子上。,下午1时47分,36,基本氨基酸中，除脯氨酸和甘氨酸外其余均属于L-氨基酸。,例外：,Pro 亚氨基酸,Gly 没有手性,下午1时47分,37,以甘油醛为参照，AA分
9、为D型和L型,有旋光性 手性碳原子,下午1时47分,38,下午1时47分,39,下午1时47分,40,下午1时47分,41,下午1时47分,42,下午1时47分,43,2.2.2 氨基酸的分类,分类依据 ：R侧链基团的结构及理 化性质的不同,下午1时47分,44,按侧链的极性：极性AA、非极性AA 按侧链的结构：脂肪族AA、芳香族AA 杂环AA、杂环亚AA 按侧链的酸碱性：酸性AA、碱性AA 中性AA,下午1时47分,45,按侧链的极性、酸碱性,非极性疏水性氨基酸 极性中性氨基酸 极性带电荷氨基酸,酸性氨基酸,碱性氨基酸,中性氨基酸,下午1时47分,46,非极性疏水性氨基酸 极性中性氨基酸 酸
10、性氨基酸 碱性氨基酸,下午1时47分,47,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,缬氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,非极性疏水性氨基酸,下午1时47分,48,下午1时47分,49,色氨酸 tryptophan Try W 5.89,丝氨酸 serine Ser S 5.68,酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66,半胱氨
11、酸 cysteine Cys C 5.07,蛋氨酸 methionine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65,苏氨酸 threonine Thr T 5.60,2. 极性中性氨基酸,下午1时47分,50,侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷。,3. 酸性氨基酸 Glu，Asp,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22,下午1时47分,51,4. 碱性氨基酸 His，Arg，Lys,侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷。,组氨酸 Hi
12、s （H） 7.59,赖氨酸 Lys（K） 9.74,精氨酸 Arg （R） 10.76,下午1时47分,52,另外：,1、蛋白质中的很多氨基酸是经过加工修 饰的修饰氨基酸 如：脯氨酸 羟基化 成 羟脯氨酸 赖氨酸 羟基化 成 羟赖氨酸 2、半胱氨酸Cys常以胱氨酸的形式存在,下午1时47分,53, 半胱氨酸,胱氨酸,下午1时47分,54,下午1时47分,55,下午1时47分,56,下午1时47分,57,人体所需的八种必需氨基酸 赖氨酸(Lys) 缬氨酸(Val) 蛋氨酸(Met) 色氨酸(Trp) 亮氨酸(Leu) 异亮氨酸(Ile) 苏氨酸(Thr) 苯丙氨酸(Phe) 婴儿时期所需: 精
13、氨酸(Arg)、组氨酸(His) 早产儿所需：色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys),下午1时47分,58,必需氨基酸 生命活动所必需的，但人体自身不能合成，必须从食物中摄取的氨基酸。 半必需氨基酸 在人体内合成速度很低，特别是新生儿或患病期，但又需要给予补充的氨基酸。 非必需氨基酸 人体自身能够合成的氨基酸。,下午1时47分,59,2.2.3 氨基酸的理化性质,. 两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,下午1时47分,60,等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电
14、中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,下午1时47分,61,氨基酸等电点的特点： 净电荷数等于零，在电场中不移动； 此时氨基酸的溶解度最小。,下午1时47分,62,氨基酸等电点的确定：,酸碱滴定 根据pK值计算： 等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。,下午1时47分,63,下午1时47分,64,方,方,下午1时47分,65,下午1时47分,66,Gly+ Gly Gly-,OH+,OH+,H+,H+,pI = (pK1 + pK2) /2 = (2.34 + 9. 6) /2 = 5.97,下午1时47分,67,下午1时47分,68,Asp+ Asp Asp- Asp=,H+,H
15、+,H+,OH+,OH+,OH+,K1,K2,K3,两性离子zwitterion,pI = (pK1 + pK2) /2 = (1.88 + 3. 65) /2 = 2.77,下午1时47分,69,H+,H+,H+,OH+,OH+,OH+,K1,K2,K3,两性离子,pI = (pK2 + pK3) /2 = (8.95 + 10.53) /2 = 9.74,Lys+ Lys+ Lys Lys -,下午1时47分,70,中性氨基酸： pIpH6.0（5.06.3） 碱性氨基酸（二氨基一羧基）： pIpH7.5 （7.610.9） 酸性氨基酸（一氨基二羧基）： pI pH3.0 （2.83.2）
16、,下午1时47分,71,计算一定pH氨基酸溶液中各离子比例,pH=pKa+lg,质子受体,质子供体,下午1时47分,72,紫外吸收,色氨酸和酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,下午1时47分,73,紫外分分光度法： 大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,下午1时47分,74,氨基酸的化学性质 茚三酮反应：氨基酸可与茚三酮缩合产生蓝紫色化合物，最大吸收峰在570nm。 该反应可作为蛋白质定性、定量分析的基础。 -氨基、 -羧基共同参与的反应。,下午1时47分,75,下午1时47分,76,与
17、甲醛的反应,OH-,中和滴定,下午1时47分,77,与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应,弱碱性,下午1时47分,78,取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高,下午1时47分,79,与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,pH8.3,无水HF,重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”,下午1时47分,80,与亚硝酸反应,在标准条件下测定生成的氮气体积，即可计算出氨基酸的量， 也可用于蛋白质水解程度的测定 注意：生成的氮气(N2)只有一半来自氨基酸,下午1时47分,81,与荧光胺反应： 根据荧光强度测定氨基酸含量（ng级）。激发波长x=390nm，发射波长m=475nm。,
18、下午1时47分,82,与5,5-双硫基-双（2-硝基苯甲酸）反应：,下午1时47分,83,硫代硝基苯甲酸,测定Cys-SH含量 （pH8.0412nm的摩尔消光系数=13600 L.mol-1.cm-1）,下午1时47分,84,2.3、肽,2.3.1 肽(peptide)的结构,肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,下午1时47分,85,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,下午1时47分,86,肽键(peptide bond)：是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键，本质为酰胺键。 氨基酸残基(residue) :肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基。
19、,下午1时47分,87,下午1时47分,88,下午1时47分,89,下午1时47分,90,* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,* 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,* 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,下午1时47分,91,下午1时47分,92,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有方向性：,N端,C端,下午1时47分,93,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,下午1时47分,94,下午1
20、时47分,95,2.3.2 几种生物活性肽, 谷胱甘肽(glutathione, GSH),下午1时47分,96,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,GSH 有抗氧化剂的作用，可还原细胞内产生的过氧化氢,下午1时47分,97,谷胱甘肽的生理功用： 解毒作用： 参与氧化还原反应： 保护巯基酶的活性： 抗氧化剂作用，维持红细胞膜的稳定：,下午1时47分,98,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2. 多肽类激素及神经肽,下午1时47分,99,促进子宫、乳腺平滑肌收缩，加速遗忘。,收缩血管减少排尿巩固记忆,加压素（升血压）,催产素,下午1时47分,
21、100,脑啡肽(enkephalin,ENK)与-内啡肽、强啡肽等合称内源性阿片肽.内源性阿片肽是体内具有阿片样活性的一类物质,分布广泛,通过作用于不同部位的各种类型的阿片受体,发挥复杂多样的生理作用.,下午1时47分,101,脑啡肽：一种能产生吗啡样作用的天然化学物质。它是发现最早(1975年)的内啡肽,属于五肽。休斯(Hughes,G.)从动物脑内分离出两种类似的五肽:一种为甲硫氨酸脑啡肽(MEnkephalin);另一种为亮氨酸脑啡肽(LEnkephalin)。发现它们局限于脑内的神经末梢,含脑啡肽的神经元都是小的中间神经元。其作用和吗啡 一样能与阿片受体呈立体专一性结合,下午1时47分
22、,102,下午1时47分,103,下午1时47分,104,2.4 蛋白质的结构 The Molecular Structure of Protein,下午1时47分,105,蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来的，具有特定分子结构的高分子化合物。 构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。蛋白质的构象通常由非共价键（次级键）来维系,下午1时47分,106,蛋白质的分子结构包括（人为划分） 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure),下
23、午1时47分,107,定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。(包括蛋白质分子中所有的二硫键的位置）,2.4.1、蛋白质的一级结构,主要的维系键：肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素,下午1时47分,108,CN键不能自由旋转 酰胺平面包括6个原子,下午1时47分,109,Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn,1 5 6 10 11 15 21,Phe-Val-Asn-Gln-H
24、is-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly,1 5 7 10 15 20,-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala,21 25 30,B链,A链,S,S,牛胰岛素的一级（化学）结构,蛋白质的一结构包括：氨基酸组成、氨基酸的排列顺序、氨基酸的连接方式,下午1时47分,110,下午1时47分,111,2.4.2 蛋白质的空间结构,蛋白质的构象 蛋白质分子中所有原子在三维空间的分布和肽链的走向,下午1时47分,112,疏水作用、离子键、氢键和 Van der Waals力等。,
25、稳定蛋白质空间结构的作用力,下午1时47分,113,下午1时47分,114,、蛋白质的二级结构,主要的维系键： 氢键,下午1时47分,115,由于C=O双键中的电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。,蛋白质立体结构原则,下午1时47分,116,肽键平面由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。,肽单元,下午1时47分,117,由于-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转,下午1时47分,118,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折叠
26、( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ),下午1时47分,119,下午1时47分,120,下午1时47分,121,-螺旋：,-螺旋是多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的螺旋构象,结构特征： 为一右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧 螺旋每圈包含3.6个氨基酸残基,螺距 0.54nm； 螺旋以氢键维系（氨基酸的N-H和相邻第四个氨基酸的羰基氧C=O之间。氢键方向与螺旋轴基本平行）,下午1时47分,123,. -折叠,-折叠是由若干肽段或肽链排列起来所形成的扇面状片层构象,下午1时47分,124,-折叠包括平行式和反平行式两种类型,
27、下午1时47分,125,反向平行,下午1时47分,126,下午1时47分,127,结构特征： 由若干条肽段或肽链平行或反平 行排列组成片状结构； 主链骨架伸展呈锯齿状； 涉及的肽段较短，一般为510个 氨基酸残基； 借相邻主链之间的氢键维系。,下午1时47分,128,. -转角,是多肽链180回折部分所形成的一种二级结构,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,. 无规卷曲,下午1时47分,129,凸起,凸起（-bugle）是一种小片的非重复性结构，能单独存在，但大多数经常作为反平行折叠片中的一种不规则情况而存在。凸起可认为是折叠股中额外插人的一个残基，它使得在两个正常氢键之间、在
28、凸起折叠股上是两个残基。而另一侧的正常股上是一个残基。,下午1时47分,130,下午1时47分,131,（四）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响,蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。,下午1时47分,132,超二级结构（supersecondary structure）,超二级结构是介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有、和等。,下午1时47分,1
29、33,蛋白质中的几种超二级结构,（A ；B 单元；C Rossman折叠，螺旋处于折叠片上侧；D 发夹；E 曲折；F 希腊钥匙拓扑结构）,下午1时47分,134,细胞色素C的结构,下午1时47分,135,细胞核抗原的结构,下午1时47分,136,纤溶酶原的结构,下午1时47分,137,、蛋白质的三级结构,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,定义,下午1时47分,139,肌红蛋白 (Mb),为单肽蛋白质，含有153个氨基酸，有8个螺旋区,下午1时47分,140,血红素结构图,下午1时47分,141,三级结构是蛋白质结构的基础 对于单一多肽链的蛋白质，三
30、级结构是它的最高级结构，只有具有完整的三级结构，才具有全部的生物学功能,下午1时47分,142,结构域,大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain) 。,下午1时47分,143,结构域是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，一条多肽链在这个域范围内来回折叠，但相邻的域常被一个或两个多肽片段连结。通常由50-300个氨基酸残基组成，其特点是在三维空间可以明显区分和相对独立，并且具有一定的生物功能,下午1时47分,144,对那些较小的球状蛋白质分子或亚基来说,结构域和三级结构是一个意思,也就是说这些蛋白质或
31、亚基是单结构域的如肌红蛋白等；较大的蛋白质分子或亚基其三级结构一般含有两个以上的结构域，即多结构域的,其间以柔性的铰链（hinge）相连，以便相对运动。,下午1时47分,145,、蛋白质的四级结构,亚基(subunit) 有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 。,胰岛素受体：由4个亚基组成(22) ，亚基与亚基形成单体(monomer)，2个单体形成二聚体(dimer)。,下午1时47分,146,亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,下午1时47分
32、,147,血红蛋白的四级结构,下午1时47分,148,血红蛋白的四个亚基紧密结合，亚基之间的维系键是亚基之间的8 个盐键,下午1时47分,149,下午1时47分,150,下午1时47分,151,2.5 蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein,下午1时47分,152,一级结构是空间构象的基础,2.5.1 蛋白质一级结构与功能的关系,下午1时47分,153,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,下午1时47分,154,蛋白质的结构是其功能的基础 蛋白质的功能是蛋白质结
33、构的延伸 蛋白质的功能可以理解为分子内和分子间各种作用力的综合，即蛋白质与其他分子的相互作用，或蛋白质在行使功能时，主要是氢键、盐键、疏水作用以及范德华力共同发挥作用的结果。,下午1时47分,155,从细胞色素c的一级结构看生物进化 物种进化过程中越接近的生物，细胞色素的一级结构越相似,一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象以及功能也相似。,一级结构与功能的关系种属差异,下午1时47分,156,例：镰刀形红细胞贫血,N-val his leu thr pro glu glu C(146),HbS 肽链,HbA 肽 链,N-val his leu thr pro val glu C(146),由
34、于单个氨基酸的变化引起血红蛋白的亲水性明显下降，从而发生聚集，使红细胞变为镰刀状,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,重要蛋白质氨基酸序列的改变可引起疾病,分子病,下午1时47分,157,2.5.2 蛋白质空间结构与功能的关系,肌红蛋白 Mb,血红蛋白 Hb,下午1时47分,158,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,血红蛋白的构象变化与结合氧,下午1时47分,159,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,下午1时47分,160,* 协同效应(cooperativity)
35、,一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity) 如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity),下午1时47分,161,血红蛋白的四个亚基紧密结合，亚基之间的维系键是亚基之间的8 个盐键,下午1时47分,162,下午1时47分,163,Hb 未与O2结合的时候，Fe2+位于卟啉环平面外侧，与F8His 连接，当第一个 O2与 Fe2+结合后， 被拉到平面中，使得牵动F8螺旋片段，导致亚基之间盐键断裂、结合变松弛，使 易于
36、与第二个亚基结合,下午1时47分,164,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,下午1时47分,165,下午1时47分,166,变构效应与协同效应,协同效应：一个亚基与其配体（O2）结合后，可影响寡聚体中另一亚基与配体的结合能力的现象称为协同效应 起促进作用的，为正协同效应 起抑制作用的，为负协同效应,别构效应：由于小分子（O2）与大分子（Hb）亚基结合，导致蛋白质分子构象改变及功能变化的现象称为别构效应。 小分子物质，称为 别构效应剂,下午1时47分,167,蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白
37、质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,下午1时47分,168,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,下午1时47分,169,疯牛病中的蛋白质构象改变 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。 PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,下午1时47分,170,2.6
38、蛋白质的性质与分离、分析技术,下午1时47分,171,（2）蛋白质的两性电离,2.6.1理化性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,* 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI),下午1时47分,172,当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点,下午1时47分,173,（3）蛋白质的变性,* 蛋白质的变性(denaturation) 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成
39、无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,下午1时47分,174,造成变性的因素 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。,下午1时47分,175,应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,下午1时47分,176,变性蛋白质的性质改变： 物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。,下午1时47分,177,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢
40、复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。,下午1时47分,178,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,下午1时47分,179,* 蛋白质沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,* 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,下午1时47分,180,（4）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100
41、万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,* 蛋白质胶体稳定的因素： 颗粒表面电荷(电荷层） 水化膜,下午1时47分,181,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,下午1时47分,182,(5)蛋白质的沉淀反应,在一定条件下，蛋白质疏水侧链暴露在外，肽链会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,下午1时47分,183,可逆性沉淀作用： 蛋白质发生沉淀后，用透析等方法除去沉淀剂，可使蛋白质重新溶于原来的溶液中。 不可逆性沉淀作用： 蛋白质发生沉淀后，不能用透析等方法除去沉淀剂使蛋白质重新溶于原来的溶液中。,下午1时47分,184,主要沉淀
42、因素及机理： 无机盐类：如硫酸铵，破坏其双电层，使蛋白质失去 电荷而析出。（盐析法） 有机溶剂：破坏水化层，使蛋白质分子间静电作用增 加而聚焦沉淀，如乙醇、丙酮等。 重金属盐类：在碱性条件下，蛋白质带负电荷，可以 与重金属离子结合，形成不溶性重金属 蛋白盐沉淀，如醋酸铅、硫酸铜等。 某些有机酸：苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等 生物碱试剂：在酸性条件下，蛋白质带正电荷，与生 物碱试剂结合形成溶解度极小的盐类， 如三氯乙酸、单宁酸等。 加热,下午1时47分,185,（6）蛋白质的呈色反应,茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应(b
43、iuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,下午1时47分,186,（7）蛋白质含量测定,考马斯亮蓝染色法,下午1时47分,187,蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,下午1时47分,188,凯氏定氮法,下午1时47分,189,2.6.2 蛋白质的分离和纯化,下午1时47分,190,（1）根据蛋白质溶解度不同进行分离,*使用乙醇、丙酮沉淀时，必须在04低温
44、下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。 *等电点沉淀法：,*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,下午1时47分,191,免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,下午1时47分,192,（2）根据蛋白质分子大小分离,* 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,* 超滤法 应用正压或离心力使蛋白
45、质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,下午1时47分,193,凝胶过滤(gel filtration) 分子筛层析,利用各蛋白质分子大小不同分离。,下午1时47分,194,下午1时47分,195,（3）根据蛋白质带电性质进行分离,电泳：蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,下午1时47分,196,几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦
46、电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,下午1时47分,197,PAGE,电泳结果,下午1时47分,198,（4）层析,层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,下午1时47分,199,主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等。,下午1时47分,200,蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 * 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。,下午1时47分,201,下午1时47分,202,下午1时47分,203,（5）超速离心 ultracentrifugation,*既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。,下午1时47分,204,因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数