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1、课题3 血红蛋白的提取和分离,专题5 DNA和蛋白质技术,思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。,一、基础知识：, 凝胶色谱法（分配色谱法）：,1、凝胶：,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）,2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离
2、。,3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,4、具体过程,凝胶色谱法分离蛋白质的原理,1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。, 缓冲溶液：,2、作用： 能够抵制（ ）的对溶液的（ ）的影响，维持PH基本不变。,外界的酸或碱,PH值,3、缓
3、冲溶液的配制,通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液。,12,使用比例,在不同PH范围内,人体血液中缓冲液:,NaH2PO4 / Na2HPO4,H2CO3 / NaHCO3,电泳：,1、概念：指带电粒子在电场作用下发 生迁移的过程。,2、原理：许多重要的生物大分子，如（ ）等都具有( ) 在( )下，这些基团会带上（ ） 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ） 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使带电分子产生不同的（ ），从而实现样品中各种分子的分离。,多肽、核酸,可解离的基团,正电或负电,所带电
4、荷相反的电极,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,一定的PH,分类：,琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。,测定（ ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳,蛋白质相对分子质量,为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是( )。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于( )。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素
5、。,SDS,单条肽链的分子量,分子的大小,聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子大得多，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸带负电荷，在电场中向正极移动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下，发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和分布的位置，可以对其鉴定。,说明：,电泳检测结果,（四）血红蛋白,在红细胞的组成中，约90%是血红蛋白。它由四个肽链组成，包括两个肽链和两个肽链。每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色。,二、实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：
6、包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,二 实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,1.样品处理,血液,血浆,水分,固体物质,血浆蛋白,无机盐 磷脂 葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞 （最多）,血红蛋白 （ ）,两个a肽链,两个一肽链,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,共四条肽链,90,（一）样品处理,1、红细胞的洗涤： 目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。
7、 2、血红蛋白的释放： 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放 3、分离血红蛋白溶液： 离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。 4、透析： 装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。,红细胞的洗涤,分离血红蛋白溶液,有机溶剂 无色透明的甲苯层,脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层,血红蛋白溶液 红色透明液体,红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物,练习巩固,1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是 A 弄清各种蛋白质的空间结构 B 弄清各种蛋白质的功能 C 弄清各种蛋白质的合成过程 D 获得高纯度的蛋白质,2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中
8、，关于蛋白质的叙述，正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较,3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是 A 调节pH B 维持红细胞的能量供应 C 防止微生物生长 D 防止血液凝固,5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数和CO2分子数分别是 A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1
9、、1 6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是： 有机溶剂-脂类物质-血红蛋白溶液-红细胞破碎物沉淀,考试宝典 考试宝典 wpe36xrz 是在这里蹲点吧！”“你就不能配合点吗。”“你又没让我配合。”被人遗忘的慕容凌娢终于从地上站了起来，但感觉自己的脑细胞正急速死亡，智商再次跌入谷底。韩哲轩怎么会知道我的真名？百蝶好像也知道他去找过夏桦。“呃”慕容凌娢强壮镇定的笑了笑，“韩哲轩你怎么会在这里？”“百蝶不是说了吗，我就是在这里专门等你们的。”韩哲轩极其爽快的承认了自己的行为，“我看见你们两个出来，就跟上了。刚想叫住你就看见你往后摔了幸好我闪的快”这剧情跟我想的怎么不一样？按照言
10、情小说的正常套路，我不是应该被人准确无误的接住吗？然后不就顺理成章的慕容凌娢居然做起了花痴的白日梦。慕容凌娢把自己的幻想和现实仔细对照了一下，又看了看面前这个笑得漫不经心的人，悲痛的捂住了脸童话里的故事果真都是骗人的自己怎么能指望这种人呢？“凌娢你怎么了？”百蝶看着一直发呆的慕容凌娢，稍许有些担忧，“不会真的摔傻了吧！”“没没事。”慕容凌娢紧张的摇了摇头，生怕百蝶看出什么端倪。“不过韩哲轩，你怎么会知道我的真名？”既然韩哲轩知道了自己的名字，也就是知道了自己一开始就说了谎，真的好尴尬啊！“像我这种开挂玩家，怎么能连这种东西都不知道呢。”韩哲轩居然没有再提起“白绫”这个化名，这让慕容凌娢很是欣慰
11、。“是夏先生告诉你的吧！”慕容凌娢绝对不会相信这是可以猜到的东西。“如果你乐意这样想，我不介意。”(古风一言)那时，谁绣芙蓉鸳鸯戏。而今，谁惹青丝千里外。第016章 原来不是青楼“是夏先生告诉你的吧！我的真名。”慕容凌娢绝对不会相信这是可以猜到的东西。“如果你乐意这样想，我不介意。”韩哲轩摊开双手，还是一副漫不经心的样子。“那看来是我想错了，你是怎么知道的？”“猜得。”“哦，原来是这样啊”慕容凌娢表面上笑着说，心里却在告诫自己，冷静一定要冷静，不能着急，不能生气这算是答复吗？太敷衍了吧！不想告诉我就直说吗，真是烦人。韩哲轩最终也没有告诉慕容凌娢他是怎么知道她的真实姓名的，因为这个话题很快就被百蝶机智的转移了，她可不想看着两个人如此尴尬的僵持在大街上，毕竟这样太引人注意了。“凌娢，你不是觉得饿了吗？赶快走吧。”百蝶拉着慕容凌娢的胳膊便将她向前拖去，强行拉开了她和韩哲轩的距离。“就是，如果为了那种小事而饿死在大街上可就划不来了。”要不是被百蝶拉着，慕容凌娢早就扑上去把韩哲轩暴打一顿了，尤其是他那张好看但欠揍的脸，总是笑得让人很不爽。不过话说回来，那个高度对她来说可能不太好触碰。“要不是害怕胳膊疼，我早就把你的脸打成猪头了！”就算打不成，气势,