高速逆流色谱分离纯化抗生素.ppt

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1、高速逆流色谱分离纯化抗生素 郑 卫 （福建省微生物研究所 福州 350007）,内 容 提 要 一 高速逆流色谱技术简介 二 溶剂选择 在逆流色谱中的重要性 三 高速逆流色谱技术分离纯化抗生素实例,一 高速逆流色谱技术简介 高速逆流色谱(High Speed Counter Current Chromatography, HSCCC) a 多层盘绕管；b 平衡物,优缺点（与HPLC等液-固色谱技术比较) 优点 分离原理不同：互补性强 无需固体作固定相 ：不存在固体对样品组分的吸附、玷污、变性、失活、拖尾等现象，能实现很高的回收率，节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗（HPLC的1/10以下），运行使用

2、的后续投入较低 溶剂极性可调：无需更换不同极性的色谱柱即可实现流动相从弱极性到强极性或相反的转化 色谱柱无填料，柱内空间全部是有效空间，容积大：样品负载能力强，制备量大，重现性好 盘管总体积100mL， 一次分离量：0.5-2克 盘管总体积3000mL，一次分离量：15-60克,缺点 分离效率（理论塔板数）还不高（1000) N=5.54(tR/W1/2)2 一次分离所需时间还较长（以小时计） 基本原理以及溶剂系统选择等还不完善 相应的配套检测器还不够完善（溶剂干扰） 分离后样品的纯度还需HPLC等方法测定 混合溶剂的回收,二 溶剂选择在高速逆流色谱中的重要性 分离度Rs: 2(tR2- tR

3、1)/W1+W2 提高分离度的方法 CCC &CPC: (tR2- tR1), HPLC: W1+W2,样品：极性、溶解度、纯度（预处理） 溶剂：两相溶剂的体积应尽量相同，挥发性较强 样品+溶剂： 沉降时间（1.5 溶剂系统： 固定相保留率：75%,表1 最佳溶剂体系选择表 极性较弱溶剂 最佳溶剂 极性较强溶剂 heptane, CHCl3 THF H2O heptane, toluene, MiBK, CHCl3, EtOAc ACO H2O heptane methyl ethyl ketone H2O THF DMSO H2O toluene, MtBE, MiBK, EtOAc MeC

4、N H2O heptane, toluene, CHCl3, EtOAc BuOH H2O heptane, toluene, CHCl3, EtOAc PrOH H2O heptane, CHCl3, EtOAc EtOH H2O heptane, toluene, CHCl3, EtOAc, BuOH MeOH H2O heptane, toluene, CHCl3, MiBK, EtOAc, BuOH HOAc H2O CHCl3 HCOOH H2O 非水体系 Heptane THF, DMF, EtOAc, PrOH, EtOH MeOH, MeCN,逆流色谱中常用的几个三元溶剂体系相

5、图 Type 1: Chloroform / Methanol / Water 应用：杆菌肽，Niphimycin，克念菌素 ，Herbicidins A, B等,Type 2. Ethyl acetate / butanol / Water 应用：WAP-8294A ，弱极性样品,Type 0: Water /Dimethylsulfoxide / Tetrahydrofuran 应用：极性强的难溶性样品如两性霉素B,CPC separation of Amphotericin B(peak 7) Water-DMSO-THF(24.6:16.2:59.2, V/V/V),溶剂系统的选择与优

6、化 步骤1:采用简单的梯度洗脱系统如水-乙腈（100:00:100）用HPLC对样品进行极性扫描分析 ，得到样品的极性范围,步骤2:溶剂系统 的优化 区域 化合物极性 溶剂系统 A 强极性 正己烷/正丁醇/甲醇/水 B 中极性 正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水 C 非极性 正己烷/乙腈 步骤3:溶剂比例的优化 一次只改变一种溶剂的量 取少量样品在试管中进行分配系数实验 TLC或HPLC测定实验结果,实例：孢绿菌素(Sporaviridins)的分离 Sporaviridins A1 A2 B1 B2 C1 C2 R1 H H H H OH OH R2 OH OH NH2 NH2 OH OH R3 C

7、2H5 CH3 C2H5 CH3 C2H5 CH3,孢绿菌素：碱性，水溶性，抗G+菌和毛癣菌等。 化学结构：含七个糖元的34元大环内酯化合物，主要有6个组分，由于结构非常相似，用HPLC等方法难以分离。 溶解性：只溶于极性溶剂如水、甲醇和正丁醇等。 HSCCC方法： 溶剂系统选择： 正丁醇/水：主要分布在上相（正丁醇），因此，必须降低孢绿菌素在上相中的溶解度。方法：加入非极性溶剂如正己烷和乙醚。 正丁醇/乙醚/水：先固定正丁醇和水的体积（各10mL)，加入不同体积的乙醚，发现10：4：10（V/V/V)效果较好。再固定正丁醇/乙醚10：4，调整水的体积，确定正丁醇：乙醚：水为10：4：12。

8、HSCCC：固定相保留率：75%，分离时间：3.5h，洗脱体积：500mL 分离前粗品15mg，分离后分别得到纯组分A1(1.4mg), A2(0.6mg), B1(0.7mg), B2(0.5mg), C1(1.1mg), C2(1.4mg)。,HPLC separation of sporaviridins. Column: Cosmosil 5C18 (5 um, 150 mm*4.6 mm), mobile phase: methanol-1 M ammonium chloride (74:26,v/v), flow rate:1ml/min, detection: 232 nm.,孢

9、绿菌素各组分在正丁醇系统中的分配系数, 分配系数（U/L） 正丁醇/乙醚/水 C2 B2 A2 C1 B1 A1 10:0:10 2.96 6.41 6.65 4.87 8.81 9.09 10:3:10 0.96 2.17 2.78 1.84 3.34 4.19 10:4:10 0.50 1.12 1.59 1.04 1.85 2.91 10:5:10 0.38 0.78 1.11 0.74 1.25 2.12 10:6:10 0.39 0.90 1.19 0.81 1.39 1.70 10:7:10 0.24 0.63 1.10 0.59 1.08 1.82 10:4:11 0.31 0.

10、89 1.24 0.70 1.50 2.00 10:4:12 0.38 1.09 1.41 0.80 1.85 2.32 10:4:13 0.37 1.05 1.51 0.73 1.58 2.10 10:4:14 0.29 1.09 1.17 0.57 1.22 1.74,HPLC separatin of each sporaviridin component. Column: Cosmosil 5C18 (5 um, 150 mm*4.6mm), mobile phase: methanol-1 M ammonium choride (74:26, v/v), folw rate: 1ml

11、/min,detection: 232 nm.,三 高速逆流色谱技术分离纯化抗生素实例 文献报道： 样品 溶剂系统 流动相 发表时间 肽类 短杆菌肽A,B,C C6H6-CHCl3-MeOH-H2O LP 1982 多粘菌素 n-BuOH-0.04MTFA(1%glycerol) LP 1991 杆菌肽 CHCl3-MeOH-H2O LP 1991 CHCl3-EtOH-MeOH-H2O LP 1991 WAP-8294A n-BuOH-EtOAC-0.005M TFA LP 2001 放线菌素类 放线菌素混合物 Et2O-nC6H14-MeOH-H2O UP 1986,样品 溶剂系统 流动相

12、 发表时间 大环内酯类 2-去甲基红霉素 nC5H12-C6H6-AcO-iPrOH -0.01M citrate buffer(pH6.3) UP 1988 尼达霉素 CCl4-MeOH-0.01MK3PO4 buffer(pH7) UP 1988 Tiacumicins CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1988 Coloradocin CHCl3-MeOH-H2O UP 1988 孢绿菌素 n-BuOH-Et2O- H2O LP 1990 霉菌素 n-C6H14-EtOAc-MeOH-8%NH3.H2O LP 1991 Dunaimycin n-C6H14-EtOAc-MeO

13、H-H2O UP 1991 原始霉素 CHCl3- EtOAc-MeOH-H2O UP 1992 伊维菌素 n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O LP 1996 螺旋霉素 n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 2000,样品 溶剂系统 流动相 发表时间 蒽环类 道诺红霉素衍生物 CHCl3-CH2Cl2-nC6H14- MeOH-H2O UP 1981 Benzanthrins A, B CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1986 Tetracenomycin D EtOAC-C6H12-MeOH-H2O UP 2005 多烯类 呋罗托霉素 CCl4-CHCl

14、3-MeOH-H2O UP 1985 克念菌素 CHCl3-MeOH-H2O UP 1987 头孢类 Cephalosporin C & PEG600 15%W/W-(NH4)2SO4 Desacetyl Cephalosporin C 17.5%W/W LP 1995,样品 溶剂系统 流动相 发表时间 其它 Pentalenolactone CHCl3-MeOH-H2O UP 1985 （内酯） Tirandamycin A, B n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 1985 Siderochelin A CHCl3-MeOH-H2O UP 1985 A 201E CCl4-

15、CHCl3-MeOH-H2O UP 1985 Bu 2313B n-C6H14-CH2Cl2- MeOH-H2O LP 1985 Sordarin derivative CH2Cl2-CF3COOH(0.04%) UP 2004 SCH 42282 CHCl3-MeOH-H2O UP 1998 (含糖大环内酰胺),我们的工作 1. HSCCC分离海洋小单孢菌产生的黄酮类化合物 HSCCC分离前粗品FW635HPLC图 HSCCC:仪器：同田生物TBE-300 CHCl3:CH3OH:H2O(4:3:2, V/V/V) Mobile Phase: LP，转速 800rpm,FW635 I 1 t

16、1 10.75min FW635I- 2 t2 11.35min,2. HSCCC分离大环内酯类抗生素 从土壤放线菌次级代谢产物中分离出两个大环内酯类抗真菌抗 生素Ac1和Ac2, 两者结构相似，难以用HPLC等色谱方法分离。 分离前HPLC分析图,HSCCC分离 仪器：同田生物TBE-300 溶剂体系选择：正己烷：异丙醚：甲醇：水 = 2：3：6：5 下相HPLC图 上相HPLC图,计算K值和值： K值：KAc1 = 上相中Ac1的峰面积/下相中Ac1的峰面积 = 1699782/2298768 = 0.74 KAc2 = 上相中Ac2的峰面积/下相中Ac2的峰面积 = 2542940/21

17、72947 = 1.17 值 = KAc2/KAc1= 1.17/0.74 = 1.58 固定相：上相；保留率； 79%；流速：1mL/min 转速：800rpm,分离后 Ac1HPLC图 Ac2HPLC图,3 HSCCC分离环孢菌素（由茄病镰刀菌产生） 环孢菌素：A，X=H, Y=CH3；B，X=Y=H；C， X=OH, Y=CH3； D， X=Y=CH3；H， (D-MeVal11) CsA 环孢菌素AB、C、D和H的化学结构,HSCCC分离纯化天然环孢菌素 仪器：同田生物TBE-300 分离前 分离后:石油醚/丙酮/水（3：3：2）, Mobile Phase: LP 组份 纯度（%）

18、收率（%） 第一部分 Cyclosporin C 99.3 85.0 第二部分 Cyclosporin B 98.7 88.5 第三部分 Cyclosporin A 98.6 90.2 第四部分 Cyclosporin D 98.4 86.3,Cyclosporin C 10.816min Cyclosporin B 11.915min Cyclosporin A 13.493min Cyclosporin D 16.043min,蒸发光散射器(ELSD)在线检测HSCCC分离,HSCCC分离环孢菌素其它组分 CsL(组分1）,HSCCC分离环孢菌素其它组分 组分2 结构待确定,HSCCC分离

19、环孢菌素其它组分 CsE(组分3）,HSCCC分离半合成环孢菌素异构体 异构体1 化学结构 HPLC分析图,异构体1分离的溶剂系统选择(石油醚/丙酮/水） HSCCC分离 石油醚/丙酮/水=3:3:2, 流动相：LP 固定相保留率：76%; 流速：1.5ml/min; 转速: 900rpm; =K2：K1 = 0.69/0.43=1.60,分离前 分离后,异构体2（顺-反异构体） HPLC分析图,异构体2分离的溶剂系统选择(石油醚/甲醇/丙酮/水） HSCCC分离 石油醚/甲醇/丙酮/水= 3：1.5：3：2, 流动相：LP 固定相保留率：83%; 流速：2.0ml/min; 转速: 900rpm; = K2/K1=1.28/0.83=1.54,分离前 分离后：2A（反式）,2B（顺式）,致谢：同田生物的大力支持 本所：方东升 季新燕 温耀明 陈振伟 陈秀明 方剑英 范建辉等 谢谢大家！,