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1、细胞凋亡与疾病,井冈山大学医学院,黄 玉 珊,pathophyiology,pathophysiology,【凋亡的生理学意义】 参与发育、生长（指间隙）。 维持内环境稳定。 参与防御反应。,凋亡诱导因素,凋亡相关基因激活,DNase激活、Caspases激活,巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞,细胞凋亡大致过程,+,cAMP、Ca2+、神经酰胺,受体,死亡信号,2、凋亡基因激活,3、凋亡的执行,一、细胞凋亡的过程与调控,凋亡时细胞的主要变化,细胞固缩、染色质边集和发芽 细胞体积逐渐缩小，细胞固缩 核质高度浓缩融合成团，染色质边集分布在核膜的边缘 内质不断扩张并与胞膜融合，形成膜表面的芽状突起,空泡化,
2、凋亡小体,1. 形态学改变,凋亡细胞与周围细胞脱接触（实体细胞） 细胞表面微绒毛消失，逐步脱离与周围细胞的接触,胞膜空泡化 胞浆脱水，胞膜迅速发生空泡化,凋亡小体 胞膜皱缩内陷，分割包裹胞浆，形成泡状小体即为 凋亡小体,内源性核酸内切酶激活,Ca2+/Mg2+增加核酸内切酶活性 Zn2+抑制核酸内切酶活性,DNA片段化,激活核酸内切酶 核小体连接区发生DNA降解 寡核小体片段（180200bp的倍数）,2. 生化改变,caspase激活及其作用 灭活细胞凋亡的抑制物；促使细胞解体；水解凋亡相关活性蛋白,细胞坏死与凋亡的差异*,1氧化损伤 氧自由基破坏了机体正常的氧化/还原动态平衡，造成生物大分
3、 子的氧化损伤，形成严重的氧化应激状态。 【机制】 DNA损伤激活p53基因 DNA损伤活化多聚ADP核糖合成酶，引起NAD消耗，ATP大量消耗、 攻击不饱和脂肪酸，生物膜脂质过氧化，直接引起细胞膜损 伤，其产物过氧羟基24碳四烯酸可诱发凋亡 激活核酸内切酶，产生膜的发泡现象 增加细胞膜通透性，钙内流增加 活化核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的表达,二、细胞凋亡的发生机制,2钙稳态失衡 各种凋亡刺激引起的细胞凋亡是钙依赖过程，凋亡发生时胞浆钙浓 度显著上升，并在随后发生的一系列凋亡改变中起关键性作用。 【机制】,二、细胞凋亡的发生机制,激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链 激活
4、谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰基转移，在肽链间 形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小 体形成。,激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录 Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露出核小体之间的连接区内 的酶切位点，有利于DNA内切酶切割DNA,3线粒体损伤 在细胞凋亡期间尽管线粒体仍能维持其超微结构的基本正常，但 其功能已发生显著改变（如线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜 的跨膜电位下降，能量合成水平显著降低等）。 【恶性网络学说】,二、细胞凋亡的发生机制,m、膜通透性、线粒体肿胀,PTP开放,Caspase-9,ATP,+,凋亡诱导因子,快速激活DNase 增
5、加capase-3的活性,Pro-Caspase-3,Caspase-3,蛋白质水解,DNA断裂,三、细胞凋亡异常和疾病,表：与细胞凋亡异常相关的疾病, bcl-2基因过表达 85%滤泡状和20%弥漫性B细胞淋巴瘤 染色体t（14;18）易位 bcl-2基因受到Ig基因增强子控制 肿瘤发生 细胞凋亡速率 bcl-2基因高表达,存在,细胞凋亡不足 1. 肿瘤（Tumor）,细胞凋亡异常,乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肺癌、胶质瘤等也存在Bcl-2高水平表达,细胞凋亡不足 1. 肿瘤（Tumor）, p53基因缺失或突变 调节P53的稳定性、细胞内定位或（和）活性发生异常 p53表达或功能存在缺陷 细胞凋
6、亡速率 肿瘤发生 （50%以上恶性肿瘤中存在P53异常）,2自身免疫病（Autoimmune diseases） 针对自身抗原的免疫细胞未被及时清除，机体产生了针对自身抗 原的体液免疫和细胞免疫，导致器官组织损伤。 清除针对自身抗原的免疫细胞以凋亡为主,细胞凋亡过度（Apoptosis excess） 1.心肌缺血与缺血-再灌注损伤 特点 缺血早期以凋亡为主，晚期以细胞的坏死为主。 在梗死灶的中心以坏死为主，梗死灶周边以凋亡为主； 轻度缺血以凋亡为主，重度缺血以坏死为主； 单纯缺血缺血再灌注损伤 急性、危重的心肌缺血以坏死为主，慢性、轻度以凋亡为主 机制 氧化应激 FasR通路 p53基因的转
7、录增加。,2、神经退行性疾病 以特定神经元进行性丧失为其病理特征的疾病 如阿尔茨海默氏病，帕金森氏病及多发性硬化症等 引起神经元凋亡的因素 -淀粉样蛋白、钙超载、氧化应激及神经生长因子分泌不足等 3、病毒感染 HIV感染引起的AIDS,-淀粉样蛋白,细胞凋亡不足与过度并存,氧化型LDL 血小板激活 Ag 高血压 内皮细胞凋亡过度 平滑肌凋亡不足,动脉粥样硬化,细胞凋亡在疾病防治中的作用,合理利用凋亡相关因素 TNF-诱导肿瘤细胞凋亡，热疗治疗肿瘤，生长因子阻断剂治疗肿瘤； 干预凋亡信号转导 以1-磷酸鞘氨醇（SPP）拮抗凋亡作用治疗AIDS； 调节凋亡相关基因 导入野生型p53基因，反义Bcl
8、-2 DNA； 调控凋亡相关的酶学机制 调节Ca2+ 、Mg2+和Zn2+浓度； 防止线粒体跨膜电位的下降 免疫抑制剂环胞霉素A；,内源性核酸内切酶的作用,H1,核心颗粒,连接区,180-200 bp,内源性核酸内切酶,Zn2+,Ca2+ Mg2+,鉴定细胞凋亡的常用方法,特性 推荐使用手段 说明,形态学 细胞表面改变 扫描电镜 微绒毛消失,芽状突起,可见凋亡小体 胞浆改变 相差显微镜 细胞皱缩,质膜变形,胞浆空泡 染色质凝聚 相差显微镜或光镜 适用于组织切片 核裂解 荧光显微镜 用结合DNA的染料标记,适用于培养细胞 流式细胞仪 定量测定DNA含量,细胞的大小和蛋白,适于 培养细胞 超微结构 透射电镜 完整的细胞器,胞浆空泡,核染色质凝聚裂解, 凋亡小体适用于组织切片或培养细胞 生化改变 DNA裂解 琼脂糖凝胶电泳 梯状条带 磁场反转凝胶电泳 可测50bp或300bp的HMW片段 TUNEL法 原位缺口平移法 基因表达 可从mRNA、蛋白层次测定，可用免疫组化、 原位杂交、Northern印迹法等,