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1、第八章 基因工程,基因工程 ( genetic engineering)、基因克隆、DNA重组、 DNA克隆、分子克隆 克隆（clone） 无性繁殖 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。,基因克隆示意图,基因工程大事记,1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因
2、家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼,1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程,胰岛素 人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体,自然界的基因转移和重组,基因重组(genetic reco
3、mbination)整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译 自然界的基因转移和重组是无目的 基因工程有目的,结合作用 质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌） 转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程,转导作用 transduction,病毒、噬菌体介导 溶菌途径；溶原菌途径,基因工程,工具酶 载体 重组DNA技术的基本过程 真核细胞转染 克隆基因的表达,工具酶,常用的工具酶：,一把特殊的剪刀 限制性内切酶的发现 阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和
4、内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖,1953年，Arber研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。 发现100-200个子代噬菌体中，只有1个可感染B，即其他的噬菌体在B中受到限制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染成功。 细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌死亡。 原因：细菌无法对自己的DNA进行修饰。 假设：限制性内切酶与修饰酶。,1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成 原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000碱基的片段。 识别和切割序列：中心对称的回文结构。 限制性酶：Hind Nathans：用限制性酶切割猴子SV4
5、0DNA，DNA测序。,限制性核酸内切酶(restriction enzyme),识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键 分类：型、型、型 命名： EcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发现次序),识别和切割位点 回文结构 46 bp 出现两种末端 粘性末端 粘端 平头末端 平端 同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点 同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端,粘性末端与平头末端,修饰酶,DNA聚合酶 逆转录酶(reverse transcriptase) T4DNA连接酶(T4 ligase) 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) 末端脱氧核苷酰转移酶(te
6、rminal deoxynucleotidyl transferase,TdT) Taq DNA聚合酶,DNA聚合酶(pol )的活性,5至3的聚合活性 5 3方向 核酸 外切酶活性 5 3外切酶活性 3 5外切酶活性 pol 经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段 大片段 （Klenow片段）：聚合活性、 3 5外切活性 常用的工具酶,核酸外切酶活性,35外切酶活性 53外切酶活性,末端脱氧核苷酰转移酶(TDT),载体 vector,DNA ，能在宿主细胞中进行自我复制和表达 克隆载体、表达载体 原核载体：质粒(pBR322,pUC） 噬菌体（，M13）等 真核载体：动物病毒载体pLXSN等
7、,常用的克隆载体,质粒(plasmid)存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 理想的质粒 拷贝数多; 两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr) 、抗四环素基因(terr)；-半乳糖苷酶基因(lac Z) 筛选标志 多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS),常用的克隆载体,噬菌体(phage) 基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、右侧区 DNA，替换型载体，外源DNA：923kb 常用：EMBL 系列、 gt 系列、charon系列 粘性质粒(cosmid)： DNA的 cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：
8、4050kb M13噬菌体 最大优点：产生单链DNA,cos:cohesive-end site,特点：,RF DNA: replicational form DNA,优点：,表达载体(expressing vector),特点：带表达构件转录和翻译所需的DNA序列 大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号 启动子：trp-lac(tac)启动子、噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子 核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列 转录终止序列,哺乳动物表达载体,真核表达元件：启动子/增强子克隆位点终止信号和加poly(A
9、)信号,重组DNA技术的基本过程,目的基因的制备 载体的选择和制备 DNA分子的体外连接 将外源DNA导入宿主细胞 目的基因的筛选和鉴定,目的基因(target DNA)的制备,目的基因（外源基因） 制备基因组DNA 基因文库(genomic library)存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合 制备cDNA cDNA文库(cDNA library) 制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成,载体的选择和制备：噬菌体、粘性质粒、 pUC系列、M13噬菌体 DNA分子的体外连接（DNA连接酶） 粘性末端连接 连接效率高 相同酶切末端 平端连接 连接效率低 人工接头(link
10、er)法 同聚物接尾法,同聚物接尾法,将外源DNA导入宿主细胞,基因工程菌 HB101,JM109 转化(transformation) 制备感受态细胞 冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态 感染(infaction) 转导(transduction) ：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程 转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。,目的基因的筛选和鉴定(screening/selection),遗传学方法 插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志选择 标志补救 表达产物与营养缺陷互
11、补 -互补 蓝白斑筛选 免疫学方法 分子杂交 探针 原位杂交 PCR 限制性酶切图谱,IPTG;X-gal(5- 溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷),bp 1534 994 695 515 377 237,A B C M,克隆基因的表达,载体有转录、翻译的元件； 密码子通用 原核表达体系 原核表达载体的标准 合适的筛选标志 强启动子 翻译控制序列 多克隆位点,融合蛋白（fusion protein,包涵体） 表达的蛋白质或多肽的N末端由原核DNA编码，C末断由克隆的真核DNA编目。 大肠杆菌表达体系的不足 缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化 融合蛋白形
12、成包涵体，复性后才有活性 很难表达大量的可溶性蛋白,真核表达体系,转染方法 磷酸钙沉淀 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染；人造膜 显微注射 筛选标志 tk- Neor G418 瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组 稳定转染 目的基因整合进宿主基因组,tk- 细胞突变株筛选转染细胞,胸苷激酶（tk） TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合成 HAT选择（H：次黄嘌呤；A：氨甲喋呤；T：胸苷） tk+：生长 tk-+带tk基因的质粒：生长,药物筛选转染细胞,neor 新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质合成 G418：干扰原核、真核生物 neo：磷酸转移酶，使G418失活 neo 与目的基因连锁,转染,目的基因的定点诱变及其应用,基因定点诱变技术 基因定点诱变技术的应用,