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1、食品微生物学实验,食品微生物学实验,实验一 微生物培养 基的配制和灭菌 实验二 放线菌和真 菌形态的观察,实 验 一,微生物培养基的配制和灭菌,一、实验目的,了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法、加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。,（二）实验材料和试剂,药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O 等。 仪器：高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯。 其它物品：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaO
2、H、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、牛皮纸、绳索、棉花、标签等。,（三）实验程序,培养基的配制 三种培养基的配方及配制 培养基和玻璃器材的 灭菌方法,据组成成分可分为: 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。 3.半固体
3、培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半固体状培养基。,培养基的种类,据组成成分可分为: 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半固体状培养基。,培养基的种类,常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。,常用凝固剂,培养基配制的基
4、本步骤,称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。 调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。 加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。 过滤 分装：注意不要污染棉塞。 包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。 灭菌 摆斜面 灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。,分装,摆斜面,培养基配制的基本步骤,分装,摆斜面,分装,摆斜面,包扎,培养基配制的基本步骤,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）配方如下： 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 氯化钠
5、 3g 琼脂 20g 自来水 1000mL pH 7.27.4 灭菌 0.1MPa，2530min,培养基的配方及配制-1,吸取 30牛肉膏 2mL；50蛋白胨 2mL；30氯化钠 2mL；加入有刻度的搪瓷烧杯中，然后用自来水补足到200mL。用玻棒搅匀，在电炉上稍加热，调 pH 至7.4 加琼脂4g，加热熔化，用玻棒不断搅拌，至琼脂完全溶解为止，趁热在漏斗架上装试带有棉塞的无菌试管，装置15的试管高度共12支，作斜面培装管。 用铝壳试管帽各装10ML，越试管高度的12以上，用作分离时倒平板用。,以配制200mL培养基为例：（30牛肉膏、50蛋白胨，30 氯化钠）,用于活化菌种， 或培养菌种的
6、斜面,用于保存菌种的斜面,搁置斜面 当培养基冷却至50左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。,注：试管加棉塞(最好) 培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内，如下图所示。,培养基的配方及配制-2,马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基（用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基），其配方如下： 去皮马铃薯 200g 蔗糖（或葡萄糖） 20g 自来水 1000mL 琼脂 20g pH 自然 灭菌： （含蔗糖）0.1MPa 20rain （含葡萄糖）
7、01kgcm 30min,马铃薯须煮沸30min之后，要用纱布过滤。,培养基的配方及配制-3,淀粉琼脂培养基（高氏一号Gause1），用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。 可溶性淀粉 20.0g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4 7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 7H2O 0.01g 琼脂 20g 自来水 1000mL 灭菌： 0.1Mpa, 30min 淀粉先用冷水调成糊状，倒入煮沸的水中。,无菌水的制备,100mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水45.0mL，试管中装9.0mL自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。三角烧瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干
8、热灭菌。,清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等。 棉塞的制作 包扎培养皿、涂棒和吸管等。,培养基和玻璃器材的灭菌方法,干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 加压蒸汽灭菌法 其步骤如下： 1.加水：灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。 2.通电：接通电源，进行加热。 3. 排气：排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。 4.恒温灭菌：当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如
9、含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。 5.结束：灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。,培养基和玻璃器材的灭菌方法,间歇灭菌法： 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。 过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。,紫外线灭菌法： 一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。 化学药剂消毒灭菌： 微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂，详见表64。,化学药剂消毒灭菌,固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？ 培养基中加琼脂的作用是什么？ 干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？ 如何检查培养基灭菌是否彻底？,思考,谢谢 ！,