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1、蛋白质化学,蛋白质一级结构的测定,序列测定的基本方法学,将肽段用不同方法专一性地切断,将得到的肽段分离纯化之后,分别测出各自的序列。再将不同方法得到的序列进行比对，就可以得到肽链的一级结构。,序列测定一般步骤,纯度要求:纯度在97%以上。 双向电泳；凝胶电泳；N-末端测定；纯化至恒定酶活； 肽谱分析。 分子量测定 多肽链的组成，二硫键的断裂。 蛋白质的氨基酸的组成。 蛋白质的配基 蛋白质的端基分析 进行正常的序列测定*,蛋白质和肽的氨基酸组成,蛋白质的水解,酸水解 6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸,105-110水解20小时。 优点:不容易引起水解产物的消旋化。 缺点:Trp被沸酸完
2、全破坏； 有-OH的Ser或Thr小部分被分解； Asn和Gln侧链的酰胺基-COOH。 注:加入0.1-1%巯基乙醇和0.05-0.1%苯酚, Tyr或Thr收率提高,碱水解 5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。 缺点: 水解过程中许多AA都受到不同程度的破坏，产率不高。 水解产物发生消旋化。 优点:Trp在水解中不受破坏。,蛋白质的水解,磺酸水解 4mol/L甲基氨酸(含0.2%-吲哚乙胺)色氨酸可回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。 用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸钠氧化，得到S-磺基半胱氨酸再测定。 缺点: 水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合
3、物时，色氨酸容易被破坏。 优点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。,蛋白质的水解,磺酸水解 4mol/L甲基氨酸(含0.2%-吲哚乙胺)色氨酸可回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。 用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸钠氧化，得到S-磺基半胱氨酸再测定。 缺点: 水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易被破坏。 优点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。,蛋白质的水解,蛋白质的水解,酶的水解 选用专一性低、水解酶活力高的蛋白酶水解，可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。 优点： 其他水解不稳定的氨基酸，如Trp、Asn、Gln等，都可以用此方法。 缺点：
4、 不容易彻底水解，也许回收率。 蛋白酶自身溶解的产物也会污染水解的氨基酸混合物。,氨基酸的分离与含量测定,特殊氨基酸的测定,色氨酸的测定,紫外吸收法 Trp与Tyr在280nm附近的光吸收成一定比例，可用方程计算出Trp的含量： 对二甲基氨基苯甲醛法 Trp在强酸条件下可与醛反应，产物在590nm下有最大吸收。此吸收值与Trp含量成正比。可用此法测量Trp含量。,巯基含量测定,DTNB法(5.5-二硫代双(-2-硝基苯甲酸) 反应产物(CNT)在412nm处可产生光吸收，根据光吸收值可以相应地计算出巯基的含量。,Protein- +R-S-S-R(DTNB),Protein-SH,Protei
5、n-S-S-R+RS-,Protein-S-S-Protein+RS-(CNT),末端氨基酸的测定,N-末端的测定,sanger反应 Edman反应 丹磺酰氯(DNS)法 氨肽酶法,Sanger反应2、4二硝基氟苯（DNFB）反应,Edman反应-PITC与多肽的反应,Edman反应,苯异硫氰酸酯（PITC）法： 多肽 or 蛋白质末端NH2PITC PTC多肽 or 蛋白质 有机溶剂 N末端的PTCAA发生环化 生成苯乙内酰硫脲的衍生物 脱离肽链 除去N末端AA后剩下的肽链仍然是完整的。 （因为，PTC的引入，只使第一个肽键稳定性降低） 干 燥 / 薄层 气相 HPLC 层析 色谱,丹磺酰氯
6、（DNS）法,封闭的N末端的测定,末端为Gln的蛋白质发生环化反应，生成焦谷氨酸酰基衍生物，此衍生物可用焦谷氨酸特异性地裂解焦谷氨酰N末端，释放出少一个Gln的肽。 释放的肽可用Edman等方法等正常方法测定。 N端甲酰基可通过温和酸水解除去，活用甲酰基酶除掉。,封闭的N端测序,C末端分析,a)肼解法 b)还原法：硼氢化锂还原剂 c)羧肽酶法（最有效、常用）,肼解法,还原法,肽链C末端AA 硼氢化锂 氨基醇 水解 C末端氨基酸+ 氨基醇 色谱法鉴定,羧肽酶法,羧肽酶法： 最有效，最常用的测C端殘基方法 性质：肽链外切酶，专一地从肽链的C端逐个降解，释放出游离AA。 常用4种羧肽酶： A 胰脏
7、能释放除Pro,Arg,Lys之外所有C末端殘基 B 胰脏 只能水解以碱性AA,Arg,Lys为C末端的肽键 C 柑桔中 Y 面包酵母,肽链的专一性水解及肽片段的分离纯化,化学裂解法,溴化氰断裂 羟胺断裂,溴化氰断裂,羟胺断裂,！能专一性地断裂-AsnGly之间的肽键,酶解法:,胰蛋白酶 R1=Lys、Arg R2=Pro（抑制水解） 糜蛋白酶 R1=Phe、Trp、Tyr；Leu、Met、His 胃蛋白酶 R1和/或 R2 = Phe、 Leu 、Trp 、Tyr以及 其他疏水残基 嗜热菌蛋白酶 R2 = Leu 、Ile、 Phe、Val、 Trp、 Tyr、Met,所得混合肽段可通过凝胶
8、过滤、凝胶电泳、离子交换柱层析、HPLC等方法分离纯化，再进行下面的测序等操作。,肽段的AA顺序测定,Edman化学降解法,第一步：偶联反应,Edman化学降解法,第二步：环化断裂反应,Edman化学降解法,第三步：转化反应,其他测定蛋白质氨基酸序列的方法,酶解法 氨肽酶 羧肽酶 质谱法 由核酸推断蛋白质序列,肽段在多肽链中次序的决定,肽谱重迭法,从不同方法断裂所得到的肽段中重叠的部分着手，得到肽的氨基酸序列。,实例,有一个十肽，N末端及C末端已事先测定分别为Ala及Val 。 糜蛋白酶水解Ala Phe+Gly Lys AsnTyr+ArgTrp+HisVal 胰蛋白酶水解 Ala PheG
9、ly Lys +AsaTyrArg+TrpHisVal 因此，得到蛋白质的序列为：Ala PheGly Lys AsnTyrArgTrpHisVal,二硫键的确定,蛋白质用胃蛋白酶充分处理 点样、滤纸中央 PH6.5 第一向电流 肽段按大小及电荷分开 滤纸暴露在过甲酸蒸汽中（SS断裂） 含二硫键肽段被氧化成氧化成 一对含半胱氨磺酸的肽 滤纸旋转90 PH6.5第二向电流 含半胱氨磺酸的成对肽段负电荷 偏离对角线 茚三酮 AA顺序分析 确定二硫键的位置,由下列信息求八肽的序列。 （a）酸水解得 Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val （b）Sanger试剂处理得DNP-Ala。
10、 （c）胰蛋白酶处理得Ala，Arg，Thr 和 Leu，Met，Phe，2Val。当以Sanger试剂处理时分别得到DNP-Ala和DNP-Val。 （d）溴化氰处理得 Ala，Arg，高丝氨酸内酯，Thr，2Val，和 Leu，Phe，当用Sanger试剂处理时，分别得DNP-Ala和DNP-Leu。,答：Ala-Thr-Arg-Val-Val-Met-Leu-Phe,一个含有13个氨基酸残基的十三肽的氨基酸组成为：Ala, Arg,2 Asp, 2Glu, 3Gly, Leu, 3Val。部分酸水解后得到以下肽段，其序列由Edman降解确定，试推断原始寡肽的序列。 （a）Asp - Glu - Val - Gly - Gly - Glu - Ala （b）Val - Asp - Val - Asp - Glu （c）Val - Asp - Val （d）Glu - Ala -Leu - Gly -Arg （e）Val - Gly - Gly - Glu - Ala - Leu （f）Leu - Gly - Arg,答：该肽链的序列可以通过将肽片段的相同序列重叠排列起来获得整个序列。,