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1、蛋白质和氨基酸的测定,1 概述 2 凯氏定氮法 3 氨基酸氮的测定,教学目标,了解蛋白质区别于其他有机化合物的主要标志；掌握凯氏定氮法、双缩脲法、茚三酮比色法、氨基态氮的测定方法及原理。 重点掌握：蛋白质系数的概念；凯氏定氮中各种试剂的用途；凯氏定氮装置的原理及操作技能；掌握PH计甲醛滴定法测定氨基态氮的原理、方法及其操作技能。,教学内容（重点及难点）,1、凯氏定氮法（蛋白质系数，氮与蛋白质之间的关系，各种试剂的用途，各种步骤的目的及注意事项） 2、氨基态氮的测定（甲醛固定氨基的作用；不同PH值指示的滴定意义）,第一节 概述,蛋白质是生命的物质基础，也是食品中重要的营养指标。 食品中的蛋白质种
2、类非常复杂，蛋白质分子量的变化范围通常为50001000,000道尔顿，它们包括氢、 碳、 氮、氧和硫等元素。,测定原理 食物中碳水化合物、脂肪中只含有C、H、O，不含有氮，含氮是蛋白质区别于其他有机化合物的主要标志，是存在于蛋白质中最为特征的元素。,蛋白质由氨基酸以不同比例构成；氨基酸由C、H、O、N以不同方法构成； 由于氨基酸种类不同和蛋白质中氨基酸构成比例不同导致蛋白质的含氮量不同,不同食品中蛋白质的含氮量为13.4%19.1%,因此，一般蛋白质含氮量为16%， 1份氮相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数，是一个平均值。,*蛋白质系数,16%,有一前提：,这些氮元素都
3、是指的是蛋白质里的氮元素，因此，当这些氮元素来源于氮元素含量极高的三聚氰胺时，是无法用蛋白质系数返算为产品中蛋白含量的。,食品中的总有机氮主要来自于蛋白质，小部分来自于非蛋白质组份的有机氮，会干扰蛋白质的测定。 食品中脂类和碳水化合物可能会干扰 一些具有相似的物化性质的组份干扰分析。,干扰蛋白分析物质:,凯氏定氮法包括有： 常量法、微量法、 经改进后的改良凯氏定氮法 这三种方法的不同之处在于： 仪器、装置、试剂等都有了改进,二、凯氏定氮法,凯氏定氮法测定的是粗蛋白的含量,因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等作蛋白质的含氮化合物，故凯氏定氮法通常将测定结果称为粗蛋白质含量。,
4、2.1.2 凯氏定氮过程步骤： 样品制备(自学) 消化 蒸馏 吸收与滴定 *学习中特别需要注意掌握各个过程中所使用的试剂都有哪些作用,2.1常量凯氏定氮法,1. 原理 消化： 样品与浓硫酸和催化剂一同加热，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。, 碱化蒸馏：然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 吸收与滴定： 用H3BO3吸收后生成硼酸氨； 再以标准HCl溶液滴定； 根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。,2.1.2.2 湿法消化,蛋白质中的氮形成铵离子和硫酸结合成硫酸铵， 硫酸氧化有机物使碳元素和氧元素被转化成二氧化碳和水。 样品中的有机物消化至透
5、明澄清.,加硫酸作用：,浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸又有氧化性，使炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫,加入量不能太大：否则消化体系温度过高，生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。 也可以加入硫酸钠、氯化钾提高沸点，效果较差,硫酸钾：增温剂，提高溶液沸点,加速蛋白质的分解，缩短消化时间，加入催化剂：,加硫酸铜作用： 加速有机物的氧化与分解 有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜褐色生成，溶液呈现清澈的二价铜的篮绿色，可指示消化终点的到达,2.1.2.3 碱化、蒸馏,消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使溶液呈碱性，加热蒸馏，释放出氨气,2.1.2.4 吸收
6、与滴定,4%硼酸吸收； 盐酸标准溶液滴定； 指示剂为混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿混合指示剂）。,甲基红溴甲基酚绿混合指示剂终点判断：,指示剂在反应过程中色泽变化: （酸性条件下为甲基红所显的红色，当体系变为绿色时则呈现溴甲基酚绿所有的绿色，因此，称为混合指示剂） 指示剂先加入硼酸中，呈现酸性红色，通入氨气后呈现变蓝绿色；用HCL一滴定，到后来又显了稍过量盐酸的酸性红色,定氮装置一、,1、电炉； 2、水蒸气发生器；3、螺旋夹a；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管9、蒸馏液接收瓶。,定氮装置二,2.1.3定氮装置的检查与洗涤 检查微量
7、定氮装置是否装好。在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。 测定前定氮装置如下法洗涤23次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子a，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b由橡皮管排出，如此数次，即可使用。,本实验的定量以氮原子的去向为准,一开始是蛋白-氨气-硼酸胺 所以必须关注这三种物质不能在检测过程中的损失，无论在消化还是吸收或是滴定过程中，都要保证其不损失,2.1.4 计算,新鲜食品中的含氮化合物大多以蛋白质为主体，先测定总氮量，然后乘以蛋白质换算
8、系数，得到蛋白质含量。 换算系数一般为6.25（100/16 = 6.25）。 即：%N 6.25 = %蛋白质,2.1.5消化过程操作注意事项：,消化时不用强火，保持和缓沸腾，以免黏附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失。 消化过程中应不时转动凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，促进其消化完全。,问题1:为什么凯氏定氮所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制,如何配制。,问题二：加硫酸铜作用,起催化剂的作用。 还可指示消化终点的到达，为清澈的蓝绿色。 指示蒸馏时的碱加入量是否足够。,问题三：消化过程中是否有大量的泡冲到瓶颈，原因是什么，如何解决？,样品中若
9、含脂肪或糖较多 开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。,消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，含有特别难以氨化的氮化合物的样品，需适当延长消化时间。 有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。,问题四：如何判断消化的终点？,问题五：蒸馏前若加碱量不足会出现什么现象，为什么，如何解决？ 若加碱量充足，消化液变为深蓝色，或产生黑色氢氧化铜沉淀，若加碱量不足，则消化液呈蓝色而无沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。,蒸馏完毕 先将冷凝管下端提离液面清洗管口 再蒸1分钟，用表面皿接几滴馏出液，以奈氏试剂检查如无红棕色物生成
10、，表示蒸馏完毕，即可停止加热。 （避免吸收液倒吸）,问题六：蒸馏完毕拆下装置时的注意事项,不能超过40，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，可置于冷水浴中使用。,问题七：为何要控制硼酸吸收液的温度？,问题八：混合指示剂颜色：,在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。,问题九：硫酸与盐酸滴定的区别,注意：H2SO4 与 HCL的区别 1/2（H2SO4）= HCL,优点：1可用于所有食品的蛋白质分析。 2操作比较简单。 3实验费用低。 4结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法。 5用微量法可测定样品中微量的蛋白质。 缺点 1最终测定的是总氮含量，而不只是蛋白质氮。 2实验时间太长
11、。 3所用试剂有腐蚀性。,本实验方法的优、缺点,2.2 微量凯氏定氮法,1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50 ml 10 ml, 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。,2.3 常量改良凯氏定氮法,2.3.1 原理及适用范围同前,在凯氏法改良中主要的问题是： 氮的完全氮化、缩短时间、简化操作 这里主要需解决的是催化剂的种类、硫酸和盐类的添加量等。,2.3.2 特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，
12、自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。,为什么在蒸汽发生瓶中要加入指示剂甲基橙和硫酸？ 加入数粒玻璃珠的作用是什么？,凯氏定氮瓶的结构,对于定氮操作：内层加消化液、加碱液是反应发生器。 外层加无氨蒸馏水、加热产生蒸汽-蒸汽从内外两层连接小口处通入，对反应液进行水蒸气蒸馏。还有一部分是氨气冷凝装置。,对于定氮瓶清洗操作：倒吸-需有压力差（内层压力应大，外层压力应小才能产生倒吸）-由于本实验装置中无产生压力装置，是利用了大气压力，和冷却水快速流过细玻璃管所产生的负压之间的压差-找寻大气压力入口，找寻负压产生入口及负压的封闭系统,三、双缩脲法,原理： 碱性条件下，铜离子和多
13、肽（至少有二个肽键，如多肽和所有的蛋白质）生成的复合物呈紫红色，吸收波长为560nm，比色所得的吸光度值和样品中蛋白质的含量成正比。,样品的测定： 自学,氨基酸态氮的测定,双指示剂甲醛滴定法,电位滴定法,四、氨基酸态氮的测定,4.1 双指示剂甲醛滴定法原理： 氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互租用而使氨基酸成为中性的内盐。 当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。 这样就可以用强碱标准溶液来滴定 -COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。,吸取含氨基酸约20mg的样品溶液于100ml容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0ml置于200ml烧杯中，加
14、水60ml，开动磁力搅拌器，用0.05mol/l氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液ml数（V10），供计算总酸含量。 加入10.0ml甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积。,而真正样品中强碱标准溶液滴定 -COOH基的过程是指: PH=8.2-9.2,此法准确快速，适用于测定食品中游离氨基酸。 固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。 但不适合颜色较深或浑浊的样品测定。,说明及注意事项,4.2 电位滴定法原理：,根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以
15、固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。,五、茚三酮比色法,原理 氨基酸（酰氨键）在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。 该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据可以测定样品中氨基酸含量。,1、凯氏定氮法是通过对样品总氮量的测定换算出蛋白质的含量，这是因为 。 2凯氏定氮法消化过程中H2SO4的作用是 ；CuSO4的作用是 。 3凯氏定氮法的主要操作步骤分为消化、蒸馏、吸收、滴定；在消化步骤中，
16、需加入少量辛醇并注意控制热源强度，目的是 ；在蒸馏步骤中，清洗仪器后从进样口先加入 ，然后将吸收液置于冷凝管下端并要求 ，再从进样口加 入 20%NaOH至反应管内的溶液有黑色沉淀生成或变成深蓝色，然后通水蒸汽进行蒸馏；蒸馏完毕，首先应 ，再停火断气。,凯氏定氮法共分四个步骤 、 、 、 。 消化时还可加入 、 助氧化剂。 消化加热应注意，含糖或脂肪多的样品应加入 作消泡剂。 消化完毕时，溶液应呈 颜色。 凯氏定氮法加碱进行蒸馏时，加入 NaOH 后溶液呈 色。 4. K2SO4在定氮法中消化过程的作用是( ). A.催化 B. 显色 C.氧化 D.提高温度 5.凯氏定氮法碱化蒸馏后,用( )
17、作吸收液. A.硼酸溶液 B.NaoH液 C.萘氏试纸 D.蒸馏水,用甲基红溴甲酚绿混合指示剂，其在碱性溶液中呈 色，在中性溶液中呈 色，在酸性溶液中呈 色。 双指示剂法测氨基酸总量，所用的指示剂是 。此法适用于测定食品中 氨基酸。若样品颜色较深，可用 处理或用 方法测定。 凯代定氮法加入CuSO4 的目的是 。 蒸馏完毕后，先把 ，再停止加热蒸馏，防止倒吸。 配制无氨蒸馏水应加入 、 来制备。,二、简答题： 1、请叙述测定黄豆中蛋白质含量的样品消化操作步骤。 2、简述凯氏定氮法的基本原理,及在测定过程中所用试剂的用途。 3、当待测样品中含有三聚氰胺时可否用凯氏定氮法测量，为什么，可用什么方法进行测量。,