蛋白质的结构和功能.ppt

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1、生物化学与分子生物学,Department of Biochemistry and Molecular Biology, CMU,绪 论,生物化学,早期主要是用化学、生物学、物理学以及数学原理研究各种形式的生命现象。 至20世纪下半叶，生物化学进入分子生物学时期，融入了遗传学、细胞生物学、生物工程学、免疫学和生物信息学等理论和技术。 因此，生物化学是一门边缘学科，也是生命科学领域重要的领头学科。,生物化学，是研究生物体内化学分子与化学反应的科学，从分子水平探讨生命现象的本质。 分子生物学，研究核酸、蛋白质等生物大分子的结构、功能及基因结构、表达与调控，揭示了生命本质的高度有序性和一致性。,生物

2、化学,生物化学发展简史,分为三个阶段： 叙述生物化学阶段(18世纪中19世纪末) 主要研究生物体的化学组成：系统研究了脂类、糖类、氨基酸；发现了核酸；分离了Hb；证实了肽键；合成了多肽,生物化学发展简史,分为三个阶段： 动态生物化学阶段(20世纪初) 营养方面：必需氨基酸、营养必需脂肪酸及多种维生素 内分泌方面：激素的发现、分离、合成 酶学方面：酶晶体 物质代谢方面：主要物质代谢途径,生物化学发展简史,分子生物学的崛起(20世纪后半叶) DNA双螺旋结构的发现 遗传信息传递的中心法则 蛋白质的-螺旋结构、胰岛素的序列分析 DNA克隆（重组DNA技术） 转基因、基因敲除、基因诊断和治疗、PCR

3、基因组学和其他组学,人类基因组计划,HGP(human genome project)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划。与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。,研究内容：遗传图谱，物理图谱，序列图谱，基因图谱,研究人员曾经预测人类约有710万个基因，但人类基因总数实际在2.6383万到3.9114万个之间，不超过40,000，只是线虫或果蝇基因数量的两倍，人有而鼠没有的基因只有300个。,蛋白质组学 转录组学 功能RNA组学 代谢组学 糖组学 ,生物化学研究的主要内容,

4、生物分子的结构与功能 物质代谢及其调节 基因信息传递及其调控,生物化学与医学,生物化学是联系生物学各学科的“桥梁” 生物化学是生命科学的基础学科，是现代医学发展的“催化剂” 生物化学的发展推动临床医学诊断、检验、治疗手段的发展，加速了生物产业的崛起,教材纲要,生物大分子的结构与功能 蛋白质的结构与功能 核酸的结构与功能 酶,教材纲要,物质代谢及其调节 生物氧化 糖代谢 脂类代谢 氨基酸代谢 核苷酸代谢,教材纲要,基因信息的传递 DNA的生物合成(复制) RNA的生物合成(转录) 蛋白质的生物合成(翻译) 基因表达调控 基因重组与基因工程,教材纲要,专题篇 细胞信号转导 癌基因、抑癌基因,第一章

5、 蛋白质的结构和功能 Structure and Function of Protein,蛋白质(protein)是许多氨基酸(amino acid)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,蛋白质的生物学重要性,蛋白质是生物体的基本组成部分 含量高 人体固体成分的45%，细胞干重的70%以上 分布广 所有的器官组织都含有蛋白质，细胞的各个部分都含有蛋白质 种类多,蛋白质的生物学重要性,蛋白质具有重要的生物学功能 生物催化剂 代谢调节 免疫防护 物质的转运与存储 运动与支持 细胞间信息传递 氧化供能,第一节 蛋白质的分子组成,蛋白质的元素组成,主要元素 C (5055%

6、), H (67%), O (1924%), N (1319%), S (04%) 次要元素 P, Fe, Cu, Zn, I, ,体内主要的含氮物质是蛋白质 各种蛋白质的平均含氮量为16% 100g样品中蛋白质的含量 =每克样品中含氮克数6.25 100,1/16%,三聚氰胺的含氮量为66%左右。 三聚氰胺的价格只有蛋白原料的1/5。 三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，无特殊气味，水溶性好，掺杂后不易被发现。,一、氨基酸,蛋白质的基本组成单位 组成人体蛋白质的氨基酸只有20种，且都是L-氨基酸(甘氨酸除外),(一)氨基酸的分类,根据侧链的结构和理化性质分五类： 非极性脂肪族氨基酸：侧链含烃链的氨

7、基酸 极性中性氨基酸：侧链有极性但不带电荷 芳香族氨基酸：侧链含芳香基团 酸性氨基酸：侧链含负性解离基团 碱性氨基酸：侧链含正性解离基团,非极性脂肪族氨基酸,极性中性氨基酸,芳香族氨基酸,酸性氨基酸,碱性氨基酸,特殊氨基酸 脯氨酸(Pro)，环型结构，属于亚氨基酸 脯氨酸在蛋白质合成加工时可被羟基化修饰成羟脯氨酸,甘氨酸(Gly)无旋光性、无L-、D-型之分,半胱氨酸(Cys),修饰氨基酸：蛋白质合成后通过修饰加工生成的氨基酸。没有相应的编码。如胱氨酸、羟脯氨酸(Hyp)、羟赖氨酸(Hyl) 非生蛋白氨基酸：蛋白质中不存在的氨基酸。如瓜氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸，这些氨基酸是在代谢途径中产生的

8、。,习惯分类法： 芳香族氨基酸: Trp, Tyr, Phe 含羟基氨基酸: Tyr, Thr, Ser 含硫氨基酸: Cys, Met 支链氨基酸: Val, Leu, Ile 杂环族氨基酸: His, Trp 杂环族亚氨基酸: Pro,(二)氨基酸的理化性质,两性解离及等电点 紫外吸收性质 茚三酮反应：当氨基酸与茚三酮共热时，AA被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮被还原，其还原产物与氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，测A570nm,二、肽,(一)肽(peptide) 肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键,+,肽键,甘氨酰甘

9、氨酸,多肽链,二肽、三肽、五肽 寡肽(oligopeptide)、多肽(polypeptide) 氨基末端(amino terminal)，也叫N-端 羧基末端(carboxyl terminal)，也叫C-端 氨基酸残基(residue) 多肽链(polypeptide chain) 多肽链从氨基末端走向羧基末端 多肽与蛋白质的分界,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,(二)生物活性肽 谷胱甘肽(glutathione, GSH),谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽 谷氨酸的-羧基形成肽键 -SH为活性基团 为酸性肽 是体内重要的还原剂,GSH的生物学功能,GSH的巯基具有还原性，保护体内蛋白质或

10、酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。 还原细胞内产生的H2O2，使其变成H2O。 GSH的巯基有嗜核特性，能与外源的嗜电子毒物结合，阻断这些化合物与DNA、RNA或蛋白质结合，保护机体免遭毒物损害。,GSH 过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,肽类激素：如促甲状腺素释放激素（TRH）,神经肽(neuropeptide),2. 多肽类激素及神经肽,第二节 蛋白质的分子结构,蛋白质的分子结构包括： 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaterna

11、ry structure),一、蛋白质的一级结构,定义： 在蛋白质分子中，从N-端至C-端的氨基酸排列顺序 主要化学键： 主要化学键是肽键，蛋白质分子中二硫键的位置也属于一级结构的范畴,胰岛素的一级结构,二、蛋白质的二级结构,定义： 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 主要化学键：氢键,(一)肽单元,参与肽键的6个原子C1，C，O，N，H，C2位于同一平面， C1和C2在平面上所处的位置为反式构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元,相邻肽单元的旋转性,蛋白质二级结构的模型,蛋白质二级结构的主要形式 -螺旋(-heli

12、x) -折叠(-pleated sheet) -转角(-turn) 无规则卷曲(random coil) 维系二级结构稳定性的主要化学键氢键,(二)-螺旋(-helix),左手螺旋和右手螺旋,结构要点: 多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧。,每圈螺旋含3.6个氨基酸，螺距为0.54nm。 每个肽键的羰基氧和第四个肽键的氨基氢形成的氢键保持螺旋稳定。氢键与螺旋长轴基本平行。 *Pro的N上缺少H，不能形成氢键，经常出现在-螺旋的末端，它改变多肽链的方向并终止螺旋,脯氨酸(Pro),(三) -折叠(-pleated sheet),结构要点： 多肽链充分伸展，每个肽单元以C为旋转点，

13、依次折叠成锯齿状结构，侧链交替地位于锯齿状结构的上下方 两段以上-折叠结构平行排列，可以顺向平行，也可以反向平行 每两链之间的肽键形成氢键，从而维持-折叠结构的稳定,(四) -转角和无规卷曲,-转角(-turn) 肽链内形成180回折 通常含有4个氨基酸残基，第一个残基的羰基氧与第四个残基的氨基氢形成氢键 第二个氨基酸残基通常为脯氨酸 无规卷曲 没有确定规律性的肽链结构,(五)模体,在蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个有规则的二级结构组合，被称为超二级结构。二级结构组合形式有3种：,模体(motif) 具有特殊功能的超二级结构，它是由蛋白质分子中二个或三个具

14、有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊功能的空间构象 一些常见的模体： 锌指 螺旋-环-螺旋 螺旋-转角-螺旋 碱性亮氨酸拉链,DNA结合蛋白的锌指结构模体,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,亮氨酸拉链,(六)侧链对二级结构形成的影响,影响-螺旋形成的因素 脯氨酸的刚性五元环，影响氢键的形成，不形成-螺旋。 多个酸性或碱性氨基酸残基相邻，由于同性电荷彼此相斥，妨碍-螺旋的形成。 侧链较大的氨基酸残基，如天冬酰胺、亮氨酸等，也影响-螺旋形成。 影响-折叠形成的因素 要求氨基酸的侧链较小,三、蛋白质的三级结构,定义： 整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，也就是整条肽链所有原子在三维空间的

15、排布位置 稳定因素： 次级键疏水作用、离子键(盐键)、氢键和Van der Waals力 共价键二硫键也参与维持三级结构,肌红蛋白(Mb),3-磷酸甘油醛脱氢酶,磷酸丙糖异构酶,结构域,分子量较大的蛋白质三级结构常可折叠成多个结构较为紧密的区域，各行其功能，称为结构域(domain),纤连蛋白分子的结构域,分子伴侣(chaperon),定义： 通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构的一类蛋白质 许多分子伴侣是ATP酶,作用： 可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合后松开，如此反复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠 与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠 对蛋

16、白质分子中二硫键的正确形成起重要作用,四、四级结构,亚基(subunit)： 每条具有完整的三级结构的多肽链，称为亚基 四级结构： 蛋白质分子中各个亚基的空间排布及亚基接触 部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构 各亚基间的结合力主要是氢键、离子键,五、蛋白质的分类,根据蛋白质组成成分,根据蛋白质形状,（辅基）,六、蛋白质组学,（一）蛋白质组学基本概念,蛋白质组（proteome）是指一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质，即“一种基因组所表达的全套蛋白质”。,蛋白质组学（proteomics）以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。,蛋白质组学研究内容： 蛋白质表达谱 蛋白质翻译后

17、修饰谱 蛋白质亚细胞定位图 蛋白质蛋白质相互作用图 蛋白质组生物信息学及数据库,（二）蛋白质组学研究技术平台,技术路线：,双向电泳技术 基质辅助激光解析飞行时间质谱技术（MALDI-TOF） 电喷雾质谱技术（ES-MS） 液相层析质谱技术（LS/MS/MS） 蛋白质芯片,蛋白质组学的研究是高通量，高效率的。,双向电泳分离样品蛋白质 蛋白质点的定位、切取 蛋白质点的质谱分析,（三）蛋白质组学研究的科学意义,解析蛋白质的表达与功能的全貌，为生命活动规律提供物质基础；为多种疾病发生发展机制的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。,第三节 蛋白质结构与功能的关系,一、蛋白质的一级结构是高级结构与功能的基础

18、,(一)一级结构是空间构象的基础,牛核糖核酸酶,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,(二)一级结构与功能的关系 大量实验证明，一级结构相似的多肽和蛋白质，其空间构象以及功能也相似 蛋白质的一级结构是由遗传信息决定的, 氨基酸残基序号 胰岛素 A5 A6 A10 B30 人 Thr Ser Ile Thr 猪 Thr Ser Ile Ala 狗 Thr Ser Ile Ala 兔 Thr Gly Ile Ser 牛 Ala Gly Val Ala 羊 Ala Ser Val Ala 马 Thr Ser Ile Ala ,不同生物来源的细胞色素c中不

19、变的AA残基,35个不变的AA残基，是Cyt C 的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化酶。,细胞色素C分子中氨基酸残基的差异数目及分歧时间,（三）氨基酸序列提供重要的生物进化信息,物种进化过程中越接近的生物，它们的细胞色素c一级结构越近似,蛋白质的一级结构是空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素,（四）重要的氨基酸序列改变可引起疾病 镰刀形红细胞贫血 -链 1 2 3 4 5 6 7 Hb-A Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys Hb-S Val-His-Leu

20、-Thr-Pro-Val-Lys,镰刀形细胞贫血病是一种致死性疾病，但它能抵抗疟疾。,分子病： 由蛋白质分子发生变异所导致的疾病。 病因：基因突变所致,二、蛋白质功能依赖特定的空间结构,(一)相似的空间结构有相似的功能,肌红蛋白 血红蛋白,（二）血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合,协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合 后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 促进作用称为正协同效应 (positive cooperativity) 抑制作用称为负协同效应 (negative cooperativity),变构效应(allo

21、steric effect),凡蛋白质（或亚基）因与某小分子物质相互作用而发生构象变化，导致蛋白质（或亚基）功能的变化，称为蛋白质的变构效应。,(三)蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象病： 若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变 这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨丁顿舞蹈病、疯牛病,疯牛病：由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变 正

22、常的PrP富含-螺旋，称为PrPc， PrPc在某 种未知的蛋白的作用下可转变为全为-折叠的PrPsc，从而致病。 PrPc PrPsc -螺旋 -折叠,水溶性差，对蛋白酶不敏感，对热稳定,第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化,一、蛋白质的理化性质,(一)蛋白质的两性电离性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下可解离成带负电荷或正电荷的基团。,蛋白质的等电点(isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH成为蛋白质的等电点。,人体大部分蛋白

23、质的pI 为 5.0左右, 因此在生理pH7.4环境下带负电荷。 pI 7.4: 碱性蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白 pI 7.4: 酸性蛋白质，如胃蛋白酶、丝蛋白 利用蛋白质两性电离的性质，可以通过电泳、离子交换层析等技术分离蛋白质。,(二)蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可 自1万至100万KD之间，其分子的直径 可达1100nm，为胶粒范围之内。 胶体性质：布朗运动、丁达尔现象、电 泳现象、不能透过半透膜、具有吸附能力,维持蛋白质胶体稳定性的因素： 表面电荷 水化膜,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,(三)蛋白质的变性 蛋白质的变性(denaturation) 在某些物理和化学因

24、素的作用下，蛋白质分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，称为蛋白质的变性。,变性的本质： 二硫键和非共价键的破坏 蛋白质变性后性质的改变： 溶解度降低，粘性增加，结晶能力消失， 生物活性丧失，易被蛋白酶水解,导致变性的因素： 加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂 临床应用： 变性因素常被应用来消毒及灭菌 防止蛋白质变性是有效保存蛋白质制剂(如疫苗等)的必要条件,蛋白质沉淀： 蛋白质变性后，蛋白质疏水侧链暴露在外肽链融汇相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出，这一现象被称为蛋白质沉淀。 变性的蛋白质易于发生沉淀 沉淀的蛋白质不一定变性 变性的蛋白质也不一

25、定沉淀,复性(renaturation)： 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。,天然状态，有催化活性,变性（尿素、-巯基乙醇）,复性（去除尿素、-巯基乙醇）,非折叠状态，无活性,蛋白质的凝固(protein coagulation)： 蛋白质变性后的絮状物经加热后可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强碱和强酸中，这种现象称为蛋白质的凝固。,(四)、蛋白质的紫外吸收 蛋白质分子中含有共轭双键结构的色氨酸和酪氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收。在此波长范围内，蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定,(五)、蛋白质

26、的呈色反应 茚三酮反应： 蛋白质经水解后产生的氨基酸可发生茚三酮反应 双缩脲反应： 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，称为双缩脲反应 *双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度,思考题： 某研究生利用紫外分光光度法测量一个八肽分子在溶液中的含量，测量得到的OD280的值接近于0，该研究生认为溶液中不含有此八肽分子。其检测结果是否可信？为什么？(八肽序列如下：Ser-Leu-Glu-Pro-Asn-Thr-Gly-Met),第五节 蛋白质的分离、纯化 与结构分析,一、透析及超滤法 透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法 超滤法： 应用正压或离心力使蛋白质溶

27、液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的,透析、超滤,二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 丙酮沉淀： 使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀,盐析(salt precipitation)： 将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀,免疫沉淀： 将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白,三、电泳(electrophoresis) 蛋

28、白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术，称为电泳,几种重要的蛋白质电泳： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质分子量的测定。 等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 双向凝胶电泳：是蛋白质组学研究的重要技术。,SDS-PAGE电泳,等电聚焦电泳： 当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。,双向电泳,四、层析 层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使

29、待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的,蛋白质分离常用的层析方法 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析：利用各蛋白质分子大小不同分离。 亲和层析：利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法,离子交换层析,凝胶过滤层析（分子筛层析）,亲和层析,五、超速离心 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量 * 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和

30、形状相关。,多肽链中氨基酸序列分析,1. 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,2. 测定多肽链的N端与C端的氨基酸残基,3. 把肽链水解成片段，分别进行分析,4. 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用 Edman降解法,5. 经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,（一）改进的Sanger法,1、分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,用于蛋白的氨基酸组成测定的水解方法主要是酸水解，同时辅以碱水解。,2、N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定,1).N-末端分析,DNFB法 DNS法 亮氨酸氨肽酶法 细胞外氨肽酶法,2).C-末端分析,肼解法； 还原成氨基醇法 羧肽酶A法 羧肽酶B法 羧肽

31、酶C法,2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基（-氨基）作用，生成二硝基苯衍生物(DNP)。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,二硝基氟苯(DNFB)法,在碱性条件下，丹酰氯(二甲氨基萘磺酰氯)可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹酰衍生物。 此法的优点是丹酰衍生物有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,丹酰氯法,多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,肼解法,羧肽酶是一种肽

32、链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,羧肽酶(carboxypeptidase)法,3、肽段氨基酸序列的测定,水解肽链的方法及特征,Edman化学降解,4、肽段在多肽链中次序的决定 数种不同的水解法使蛋白质分子在不同部位断链，找出多套肽段的重叠部位，然后组合排列对比，即可推断肽段的排列顺序，从而得出完整肽链中氨基酸的顺序,(二)通过核酸推演的方法,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,