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1、缝隙连接研究进展 杨耀琴,（Gap junction ）,细胞间的粘附和特殊的连接结构是组织形成的重要因素。,二、缝隙连接的发现,缝隙连接是所有的细胞连接中最引人关注的一种连接，分布最广，几乎存在于所有动物，并且在很多组织中是大量存在。 这种细胞与细胞间的通讯现象是1958年在生理学的研究中首先观察到。但电子显微镜发现缝隙连接结构的存在，证实这一细胞偶联生理现象化费了十多年的时间。, + + + +,实验过程,小龙虾（crayfish）神经细胞间相互作用实验： 用一个电极插入一个细胞，在邻近的细胞出现一个超乎想象的大电流，表明离子能够自由地从一个细胞的内部进入另一个细胞。, + + + +,缝
2、隙连接通透性示意图,注入一个细胞内的小分子荧光染料同样能容易地进入邻近的细胞，并且没有细胞外间隙的泄漏，只要分子小于1000d。提示孔道大约1.5nm，偶联的细胞共享它们的小分子（如离子、葡萄糖、核苷、氨基酸和维生素等）。,三、缝隙连接的组成、分布与结构,一）缝隙连接的组成 缝隙连接由相邻细胞膜上的两个连接子（connexon）相互锚定组成，连接子是一个六聚体，由六个亚单位连接蛋白（connexin，Cx)组成。,连接蛋白是由10余个成员组成的一个保守大家族； 分子量由2656KD不等，可分为-Cx和-Cx； 至少由13个基因编码； 与其它种属有较高的同源性，主要的差别在于Cx分子的胞浆部分。
3、,连接蛋白的共同特点：,四个跨膜亲水片段称为M1-4，为螺旋结构； 两个胞外环（Extracellular loop）分别称为E1-2 一个胞浆环（cytoplastic loop/CL）； 羧基末端与氨基末端位于胞浆内； 羧基末端则差别较大。其丝/苏及酪氨酸残基的磷酸化/去磷酸化水平影响着缝隙连接的形成及功能状态，能感受胞内的信息变化，调节缝隙连接的形成及传导性。,连接蛋白可寡聚成六聚体即连接子或称半通道(hemichannel）。 连接子可由单一连接蛋白组成称同聚体连接子（homometic connexon）， 连接子由几种连接蛋白构成称异聚体连接子（heterometic connex
4、on）。 异型缝隙连接（heterotypic gap junction） 同型缝隙连接（homotypic gap junction）。,二）缝隙连接的电镜结构,三）缝隙连接的分布,上皮细胞 骨细胞、成骨细胞、软骨细胞 心肌细胞、平滑肌细胞 神经细胞 小鼠视网膜色素上皮细胞 胰岛素分泌细胞 晶状体上皮细胞 卵泡细胞等。,四、缝隙连接的功能,缝隙连接具有传导快、低阻抗、延搁时间短的特点，相邻的细胞可以共享小分子物质，因此可以快速和可逆地促进相邻细胞对外界信号的协同反应。在肿瘤生长和创伤愈合等过程中都观察到缝隙连接某些类型连接子表达的变化。因此，连接子可能对细胞的生长、分化、定位及细胞形态的维持
5、具有重要意义。主要的生理功能有以下几个方面。,一）细胞通讯（Cell Communication）,细胞通讯是指一个细胞通过信号的传递使另一个细胞产生相应的反应的过程。 细胞间的通讯对于多细胞生物体的发生和组织的构建，协调细胞的功能，控制细胞的生长和分裂是必需的。,细胞间的通讯方式,间接通讯,接触性依赖的通讯,直接通讯GJIC,直接通讯： 以细胞间的缝隙连接（gap junction，GJ）为途径进行的细胞之间的直接信息交流，称为直接通讯，又称缝隙连接细胞间通讯（gap junction inter-cellular communication / GJIC）。,协调细胞间活动的一致性：,细胞
6、通过缝隙连接对可共享一些小分子代谢物，更常见的是cAMP、Ca 2+等信息分子，因此，具有缝隙连接的细胞对外界信号刺激具有迅速、一致的反应。,在心肌细胞，它的收缩活动具有全或无的特点，细胞间收缩功能的协调是通过缝隙连接来完成的。在体外培养的大鼠心肌细胞中，随着细胞间的缝隙连接增多，细胞由不规则收缩趋向同步收缩。,在两个神经细胞之间，它允许动作电位无延迟地迅速在细胞与细胞间传播（不同于化学突触）。这在有些情况下是非常重要的，如鱼、昆虫的某些逃避反应。 在高等脊椎动物的心肌细胞的收缩和肠道平滑肌细胞的蠕动反应等。 非可兴奋细胞 如纤毛摆动等协调运动中有着缝隙连接的作用。,参与信息传递及神经冲动的传
7、导,缝隙连接横跨在细胞膜上，组成了细胞之间的电学连贯性。,不同的细胞间离子通道比较,缝隙连接通道有至少两种传导状态，完全传导状态和亚传导状态。当电压等条件发生变化时，通道并不完全关闭，而是长时间的处于亚传导状态，此时，通透性可能会发生变化，例如大分子的通透可能会减少。,许多connexin分子组成的通道具有电压敏感性特性，在细胞之间电压变化的条件下关闭。 缝隙连接的交替开放，象其它“门”一样，可调节胞质pH和Ca2+等离子的浓度。这种变化可能是部分性的，不能完全破坏细胞之间的电学连贯性。,Ca2+经缝隙连接传导的细胞还包括： 成骨细胞、软骨细胞、小鼠视网膜色素上皮细胞、胰岛素分泌细胞、羊的晶状
8、体上皮细胞等。 细胞外高浓度的Na+、 Ca2+流入损伤的细胞，能诱导缝隙连接迅速关闭，以避免邻近偶联细胞的损伤。,GJ是神经元电突触的结构基础，在神经元电活动的维持、神经元快速同步化、神经元的发育中起着十分重要的作用，同时还参与传递第二信使及整合胶质细胞的活动，在癫痈形成和发展过程中发挥了重要作用。缝隙连接阻断剂能够抑制细胞自发性放电频率，因此，应用缝隙连接阻断剂有望成为治疗癫痈的新方法，为癫痈治疗提供了新思路。,二）参与细胞的分化生长与发育：,胚胎期8细胞桑葚胚期，细胞间均有缝隙连接； 当细胞开始分化，则脱离细胞群；神经管形成与此有关：,假说： 一些小分子借助缝隙连接从高浓度区上皮向低浓度
9、区上皮组织转移，形成浓度梯度，局部的“浓度”提供了“细胞的位置”信息。根据细胞在胚胎中的“位置”从而能控制细胞的分化。是否如此，尚未定论。 在生长发育过程中，一种Cx的表达可诱导或抑制其它Cx的表达，从而参与诱导细胞的正常分化生长。,在胚胎期小鼠心脏发生中，准确的缝隙连接调节是保证心脏正常发生的关键，缺少Cx43基因的新生小鼠心脏发生异常。Cx43-/-纯合子小鼠出生不久即死亡。 在生长发育过程中，一种Cx的表达可诱导或抑制其它Cx的表达，从而诱导细胞的正常分化生长。,GJ对卵泡发育的作用：,卵巢中的卵泡处于无血管的微环境中，因而缝隙连接介导卵母细胞和颗粒细胞、卵泡膜细胞的代谢交换，传递内分泌
10、和旁分泌的生长因子。卵泡的整个发育过程离不开细胞间的缝隙连接。连接蛋白Cx32、Cx37、Cx43、Cx45和Cx57参与卵泡的发育，其中Cx43和Cx37对卵巢卵泡的发育起了至关重要的作用。,连接蛋白在原始卵泡上几乎不表达，偶尔在初级卵泡上表达。而在次级卵泡上（无论小鼠性成熟与否）均发现连接蛋白的表达。随着卵泡的发育，连接蛋白的表达亦增加。在卵泡成熟过程中缝隙连接是颗粒细胞增殖所必须的。,卵泡细胞间的缝隙连接对于卵泡的发育以及甾类激素的分泌具有十分重要的意义。颗粒细胞通过缝隙连接持续低水平发送信号至卵母细胞，从而使卵母细胞滞留在减数分裂阶段。此外通过诱导信号途径(也是一种缝隙连接)使卵母细胞
11、最终成熟。而卵母细胞不仅接受调节信号，还发送信号控制卵泡的发育，调节卵母细胞的转录活力，诱导各种卵母细胞蛋白翻译后的修饰， 所有这些信息的传递是通过缝隙 连接完成的。,GJ与视网膜,视网膜各层及各种细胞均有丰富Cx的表达，不同的动物种类和不同的视网膜细胞可以表达不同的Cx。胚胎期眼球和视网膜的生长发育、成年视网膜正常生理功能的形成等均与Cx的表达密切相连，并且这些Cx的表达和功能可以被外界环境所影响，从而达到调节视网膜功能的目的。,在肿瘤发生中， GJIC中断在肿瘤细胞的生长、转移中起重要作用，在肿瘤组织中，缝隙连接的数目明显减少，体外将肿瘤细胞与表达正常Cx43的正常组织细胞共同培养，则肿瘤
12、细胞向正常分化。 Cx表达减少或定位异常常引起GJIC的下降，常导致细胞异常生长和肿瘤发生，Cx被认为是肿瘤抑制蛋白。 Cx的非通讯功能与细胞生长及肿瘤有关。新近的研究认为Cx本身可直接参与细胞生长的调节，不一定必须通过GJIC发挥作用。,五、 GJIC与肿瘤形成：,肿瘤自杀基因治疗 自杀基因治疗: 恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。 原理: 将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。,旁观者效应： 肿瘤基因治疗中，转染自杀基因（如胸苷激酶，HSV-TK）的肿瘤细胞被杀死，其周围一些未被转染基因
13、的肿瘤细胞，在药物前体如丙氧鸟苷（Gancyclovir, GCV）的作用下也被杀死的现象，称旁观者效应（bystander effect） GJIC是“旁观者效应”的结构基础之一；,例如： HSV Gene-TK（单纯疱疹病毒胸苷激酶基因） GCV-p 掺入DNA合成，延长终止 肿瘤细胞死亡 邻近细胞死亡 凋亡（旁观者效应）,肿瘤细胞,转染,GCV（胸苷类似物）,-TK,TK,自杀基因的作用机制,六、缝隙连接与心血管疾病,在心血管系统中，心肌细胞及内皮细胞与平滑肌细胞间存在着丰富的缝隙连接，因此缝隙连接的功能失常将引起各种心血管疾病。,研究显示，在成人心脏Cx43含量最为丰富，主要存在于工作
14、心肌细胞内。Cx40、Cx45含量较少，Cx40主要分布于心房及近端传导系；Cx45分布于整个传导系统，是窦房结和房室结缝隙连接的主要成分。心脏不同部位连接蛋白的表达和分布情况与其电传导功能密切相关。,心脏的缝隙连接(GJ)由connexin构成介导心肌细胞间电化学信息交流的特殊通道，该通道具有亲水性、通透性高、低选择性、纵向阻抗低和保持开放状态等特性。缝隙连接是心肌细胞间电耦联的结构基础，它实现细胞间电信号和化学信号的通讯联系从而确保心脏牛理活动的协调性和同步性。 近年来随着对其研究的深入，GJ与心血管疾病的关系，尤其是GJ在心律失常发生中的作用正备受关注，以GJ为作用靶点治疗心血管疾病及开
15、发抗心律失常新药成为当今心血管界具有潜力的研究热点。,一）心律失常：,心肌纤维化常伴有较高的室性心律失常，其最明显的病理结果是将心肌细胞隔离开来，从而失去缝隙连接的连接，失去电复极的一致性，为折返的形成创造了条件。 心肌缺血、心肌梗死后及心肌病，心律失常是最常见并且是潜在的具有生命危险的并发症。原先的缝隙连接发生重构，缝隙连接沿侧壁垂直族集排列，为室性心律失常形成折返环路。缝隙连接的组织方式明显不规则，缝隙连接已不限于闰盘，而广泛地分布于细胞表面。 感染后激素及体液免疫功能的改变可能也影响着缝隙连接的功能。,血管内皮细胞和平滑肌细胞间的相互调节是血管生理和病理学研究的重要内容之一。近年研究发现
16、，缝隙连接在血管内皮细胞与平滑肌细胞间相互调节过程中起着重要作用。,二）动脉粥样硬化,目前认为，动脉粥样硬化的发生被认为是一个类似肿瘤发生的一种良性过程。在肿瘤发生中，GJIC的中断是必需的，缝隙连接的功能及数目的改变必然与动脉粥样硬化的发生也密切相关。 在动脉粥样硬化发生过程中，血液中白细胞、单核/巨噬细胞与内皮细胞的VCAM-1结合而粘附，从而诱导缝隙连接Cx43的表达。由此推测，缝隙连接的形成，可能与单核/巨噬细胞的锚定、趋化渗透及吞噬脂质有关。,三）高血压,高血压等模型标明, 动物的动脉结构和功能发生改变时, 其主动脉内皮细胞的Cx43蛋白的表达较正常对照组减少了35%, 而Cx37
17、减少了59%; 利用基因敲除技术, Cx40 基因缺失的小鼠均出现高血压，血管调节变得十分不规律; 特异性敲除小鼠内皮细胞的Cx43 基因会导致低血压 内皮-平滑肌之间的肌内皮GJ参与了血管紧张度的调节。,越来越多的研究表明, GJ 参与了许多心血管疾病, 并且发现GJ 重构在这些疾病中的发生、发展过程中起着重要作用。但机体如何影响GJ 重构的确切机制还有待研究。因此, 进一步研究GJ 重构具体机制, 并开发具有靶向逆转或抑制GJ 重构的药物将是未来研究的新方向。,小 结,缝隙连接分布广泛，几乎存在于所有的动物细胞中。用电镜可显示相邻两细胞的连接处的细胞质膜明暗相间七层结构，其内有间隔的均匀排
18、列的颗粒。用冰冻断裂电镜技术显示缝隙连接的颗粒区面积大小不等，且排列规则而密集。用X线衍射技术证明，每个颗粒由6个蛋白质亚单位构成，它们呈环行排列，中间有直径2纳米左右的小孔，被称为连接小体（connexon）。,缝隙连接只允许分子量小于1200的物质自由通过，如无机离子，氨基酸，葡萄糖及维生素等。缝隙连接是一种动态结构，有多种因素参与调节通道的开放和关闭，如细胞内pH、Ca2+浓度和细胞膜电位等。 缝隙连接有多种功能，它与细胞通讯和电兴奋的传导、生长和分化，物质的代谢和运输等有密切关系。,要点：,缝隙连接的组成、分布与结构 缝隙连接细胞通讯作用及意义 缝隙连接与分化 缝隙连接与疾病,旁分泌（paracrine）和自分泌（autocrine）,膜表面分子接触通讯举例,