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1、2019/8/27,荧光分光光度计的原理及应用,2019/8/27,一、分子荧光的产生,1.电子激发态的多重度 单重激发态S：电子自旋方向和处于基态轨道的电子配对。,第一节 荧光分光光度法原理,三重激发态T：电子自旋方向和处于基态轨道的电子平行。,2019/8/27,2. 分子能级与跃迁 基态(S0)激发态(S1、S2激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射。 激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；,2019/8/27,2019/8/27,二、激发光谱与荧光光谱,1.荧光的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与激发光波长
2、的关系曲线 （图中曲线I ） 。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；,2019/8/27,2.荧光光谱,固定激发光波长, 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线(图中曲线II)。 问题：荧光(磷光)的激发光波长如何选择？Stokes位移：激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长。,2019/8/27,三、荧光强度和溶液浓度的关系,1 定量依据 荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓
3、度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc （浓度高时如何？）,2019/8/27,标准曲线法定量： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度； 比较法定量： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。,2 定量方法,三、荧光强度和溶液浓度的关系,2019/8/27,四、荧光、磷光分析方法的特点,（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高24个数量级；为什么？ 分光光度法所检测的是两个较大的信号的微小差别，荧光光度法检测的是很小背景值上的荧光强度。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据
4、特征吸收光谱； （3）试样量少 （4）可提供比较多的物理参数 缺点：应用范围小。,2019/8/27,第二节 荧光分光光度计的组成,测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器成直角。,基本流程如图： 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器； 光源：氙灯?和高压汞灯，染料激光器 检测器：光电倍增管。,2019/8/27,仪 器 光 路 图,问题：参考光电管作用？,2019/8/27,第三节 荧光分析法的应用,(1)无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 (2)生物与有机化合物的分析 见表,2019/8/27,2019/8/27,2019/8/27,作业,P14 3,