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1、1,博士，北京大学基础医学院病原生物学系副教授，硕士研究生导师,SCI期刊Journal of Gastroenterology and Hepatology、Archives of Virology和Immunological Investigations和中国病毒病杂志、中华微生物学和免疫学的长期审稿人,主要研究课题 艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项“十二五”课题“乙型和丙型病毒性肝炎诊断及临床监测的研究”子课题“新研制及优化试剂的质量评价”（批准号：2012ZX10002005-004）； 科技部863课题“高灵敏检测试剂及基于基因组的诊疗技术”（批准号：2012AA022
2、605） “艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项“十一五”课题 “丙型肝炎的临床转归及难治性丙肝的机制和治疗方案优化”（批准号：2008ZX10002-013）。 国家自然科学基金面上项目“HCV慢性感染者和病毒自发清除者外周血单核细胞介导的固有免疫应答特征研究”（批准号：81271826）。,沈 弢 北京大学 病原生物学系 ,2013-06-02,2,“十一五”重大传染病专项计划病毒性肝炎重大研究专项启动(2009年),表1 、国家中长期科技发展规划纲要（20062020年）确定的重大科技专项,Hepatology, 2009 J Hepatol, 2012,2012：为了避免乙
3、肝复发，HBV DNA需控制在实时荧光PCR检测不到的水平（10-15IU/ml）。HBV DNA的监测是检测治疗失败的关键。,2009：目前，HBV DNA实时荧光定量PCR的灵敏度以达到5-10IU/ml，检测上限以达到8-9log10，用高灵敏度的定量检测试剂准确检测血清HBV-DNA是乙肝抗病毒治疗过程中疗效观察和治疗终点判定的关键因素。,超敏感（Hypersensitivity） 乙肝检测灵敏度应达到10-15IU/ml，丙肝检测灵敏度达到50IU/ml，从而帮助医生确定治疗终点，同时及时监测耐药的发生。 宽线性范围（ wider dynamic range ） 试剂盒线性定量范围应
4、为1-9log10IU/ml，以帮助医生准确测定病毒感染的基线水平，并有效评估抗病毒治疗的效果，为患者提供最优治疗方案。 高特异性（ High specificity） 试剂盒应能够检测肝病毒各基因亚型，有效避免假阴性及漏检情况的发生。 可重复性好（ Repeatability） 试剂盒操作过程要简单，以最大程度上减少操作误差，同时检测结果的重复性要好，以保证肝病治疗过程中监测指标的准确性和有效性。,国际指南对HBV DNA检测的要求,我国曾是世界上HBV感染流行最高的地区之一,WHO/CDS/CSR/LYO/2002.2:Hepatitis B,9.75%,全国13亿人口，5-6亿曾感染HB
5、V, 占全国总人口近40% 159岁人群血清HBsAg流行率 7.18% (2006),FM Lu, et al. J. of Viral Hepatitis 2009 FM Lu & H Zhuang. Chiness J. of Medicine X.Liang, et al. J.of Infectious Disease, 2009 X.Liang, et al. Vaccine, 2009,（一） 慢性乙型肝炎 （二） 乙型肝炎肝硬化 （三） 携带者 （四） 隐匿性慢性乙型肝炎,慢性乙型肝炎临床诊断类型,临床诊断 临床症状、疾病史 实验室诊断 生化学检查 HBV血清学检测（抗原/抗体
6、系统） HBV DNA（基因型、亚型和变异检测） 病理学诊断 影像学诊断,诊断依据,慢性HBV感染临床诊断,HBV携带者(HBV DNA+),携带者,慢性乙肝,HBeAg-慢乙肝,乙肝 肝硬化,乙肝相关肝癌,隐匿性慢性乙肝,非活动性HBsAg携带者(HBV DNA),轻、中、重,活动期和静止期,代偿期,失代偿期,HBeAg+慢乙肝,医药科技的进步已经使慢性乙型肝炎已成为可以治疗的慢性疾病,2005年我国制定了第一部 慢性乙型病毒性肝炎防治指南,规范的抗病毒治疗可以有效地阻断或减缓疾病进展、减少终末期肝病的发生,免疫耐受期,HBeAg+ HBeAg-/anti-HBe+ (preC/core p
7、romoter mutants),HBV DNA, 2000 IU/mL, 2000 IU/mL, 2 x 107 IU/mL, 2 x 104 IU/mL,(HBeAg+ CHB),(Inactive-carrier state),(HBeAg- CHB),ALT,Normal/minimal change/mild CH,Moderate/severe CH,Moderate/severe CH,Normal/mild CH moderate fibrosis,Cirrhosis,Cirrhosis,Inactive cirrhosis,2-6%/yr,8-10 %/yr,20-30%,M
8、odified from Lok et al. Hepatology 2007;45:507-539 Pungpapong et al. Mayo Clin Proc 2007;82:967-975.,免疫清除期 （免疫活动期）,免疫控制期 (低病毒复制期),再活动期,侯金林教授惠许,临床治疗的进步对实验室检测提出了新的要求,慢性HBV感染分期及相关实验室检测指标,鲁凤民，庄辉，乙型肝炎实验室诊断研究进展 2009,慢性乙型肝炎的诊断 开展抗病毒治疗的重要指标： HBeAg阳性慢乙肝患者：HBV DNA 20 000 IU/mL，伴有肝脏损伤者 (ALT升高，或肝活检发现肝脏炎症)； HBeA
9、g阴性慢乙肝患者：HBV DNA 2 000 IU/mL伴有肝脏损伤指标，即应开始抗病毒治疗。 代偿期肝硬化患者：HBV DNA +,HBV DNA的定量检测已经成为临床治疗的关键指标,HBV DNA的定量检测已经成为临床治疗的关键指标,判断抗病毒治疗疗效（RGT） 以治疗24周时血清HBV DNA绝对水平判断： 完全病毒学应答：低于60 IU/mL 部分应答： 低于2 000 IU/mL 应答不充分： 60 IU/mL 2 000 IU/mL,例如：HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用,例如：HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用,HBV DNA的定量检测已经成为临床治疗的
10、关键指标,在多个国家和地区的慢乙肝防治指南，均把用灵敏的PCR检测方法检测不到HBV DNA作为停药的重要指证。,Domestic A,Ampllcor Monltor,Cobas TaqMan,RealArt HBV LC PCR (ArtusBiotech),Abbot Real-time HBV (Abbott),Versant HBV DNA 1.0 (kPCR,Siemens),10,102,103,104,105,106,107,108,109,(IU/mL),HBV DNA定量检测试剂及其检测灵敏度和线性范围,Domestic B,以上数据来源：各企业试剂说明书,国产乙肝病毒DN
11、A定量试剂在检测方法上与进口试剂存在明显差别,原因分析,一步法煮沸释放HBV DNA + 定量扩增,自动化提取制备HBV DNA + 扩增检测,VS,1ul,国产试剂的实际用于检测的血清量仅为1 ul,200ul,国内现有核酸检测技术流程,PCR体系配置,核酸提取,荧光PCR仪器操作,PCR体系配置，核酸提取，荧光PCR检测。 一站式全自动检测！,国外的全自动核酸检测仪器,国产乙肝病毒DNA定量试剂质量的提高需向系统（试剂+体系）转换,对策1：技术进步，全自动的核酸提取设 备+基于开放设备的定量试剂 对策2：通过行政手段淘汰劣质试剂； 对策3：由维价格论综合考虑质量与价格,我们已经完成配合自动
12、化仪器的磁珠核酸提取试剂，达到国外先进水平。,圣湘公司磁珠法提取效果,国外著名C公司提取效果,圣湘公司自主研发的核酸提取试剂（磁珠法），实现了DNA/RNA共提取。效果等效于国外著名同类试剂。 HBV灵敏度可达10IU/ml，HCV灵敏度达20IU/ml。,10IU/ml,磁珠核酸提取试剂可在各种不同仪器上进行下游检测,30,定量检测HBV感染者血浆 (清) HBV DNA是了解肝内HBV复制水平的可靠指标，也是HBV感染诊断、疗效监控和指导用药的重要指标。 近年，国产试剂的质量得到很大改进，但多数试剂的灵敏度、准确性及重复性等与进口优质试剂相比，仍存在较大差距。尤其对低病毒载量或存在干扰物质
13、的临床标本进行检测时，差距更为明显。 目前我国市场上主流的国产HBV DNA定量试剂盒多是基于即将废除的煮沸法核酸提取方法，检测下限一般为5001000 IU/ml，不能满足临床诊断的需求。 在国家“十二.五”传染病防治重大专项“乙型病毒性肝炎临床诊断及监测技术的研究”的支持下，基于磁珠法核酸提取的国产HBV DNA定量试剂盒已成为主流研发方向。,31,对国产湖南圣湘乙型肝炎病毒核酸定量检测（PCR-荧光探针法）试剂盒的可溯源性、准确度、精密度和临床应用进行质量考评。,32,用基于磁珠法自动化核酸提取平台的该国产HBV DNA定量试剂盒和罗氏HBV DNA定量试剂盒对WHO的 HBV DNA系
14、列稀释标准品 (50、200、2000、20 000 IU/ml) 进行溯源性分析，确定试剂盒检测的可靠性。 用这2种试剂盒对HBV B和C基因型标准血浆 (分别稀释为25、50、200、2 000、20 000、200 000 IU/ml) 分别在三个不同检测中心共进行216次平行检测，比较其准确度和精密度。 用2种方法平行检测5份HBV DNA阴性血浆样本和37份不同病毒载量的HBV DNA阳性临床血浆标本，并评价其相关性和符合率。,33,34,35,Roche COBAS,Roche COBAS 2.0,湖南圣湘,ABBOTT kit,36,37,购买获得WHO HBV-DNA 标准物质
15、，用于评价不同公司HBV-DNA定量检测方法的可溯源性（traceability）。 HBV标准品将用HBV阴性EDTA抗凝血浆进行稀释。稀释浓度初步设定为50、200、2,000/20,000 IU/mL四个临床治疗关键的节点浓度值。 每天每种仪器检测上述稀释浓度样本一个反应（含对照管）。共检测三天（即每种浓度检测3次）。 以上检测均在北京大学医学部微生物系进行。,38,WHO genotype A2 Panel,Roche COBAS 2.0,Sansure,Rep 1,Rep 2,Rep 3,Rep 1,Rep 2,Rep 3,Day 1:,Day 2: repeat the above
16、 testing pattern,Day 3: repeat the above testing pattern,NIBSC：英国国家生物标准与检定所,39,40,由第三方提供高浓度的HBV B&C亚型标准血浆。血浆HBV病毒载量须大于1,000,000。 以上血浆用HBV阴性EDTA抗凝血浆进行稀释。稀释浓度设定6个评价节点：25、 50、200、2,000、20,000 、200,000 IU/mL。 每天每种仪器检测上述稀释浓度样本一个反应（含对照管）。共检测三天（即每种浓度检测3次）。 准确度判断标准为所有检测节点上的的相对偏差 均在0.3 lg IU/ml之内为可接受范围。精确度判定
17、依据对同一检测节点平行检测9次后的变异系数，变异系数越小意味精确度越高。 以上检测将在北京大学医学部微生物系、首都医科大学附属佑安医院、湖南湘雅医院传染病科三地多中心同时进行。,HBV B基因型标准血浆：卫生部国家临检中心惠赠，编号GBW09150，浓度为1.2106 IU/ml。 HBV C基因型标准血浆：中国药品生物制品检定所惠赠。浓度为2108 IU/ml。,41,Day 1:,Day 2: repeat the above testing pattern,Rep 1,Rep 2,Rep 3,Rep 1,Rep 2,Rep 3,Sansure,Genotype B Panel,Roche
18、,Rep 1,Rep 2,Rep 3,Rep 1,Rep 2,Rep 3,Sansure,Genotype C Panel,Roche,Day 3: repeat the above testing pattern,42,43,国产新型试剂盒的检测结果较稳定，相对偏差均在0.1lg IU/mL范围内。 罗氏试剂盒的检测结果尽管均在可接受范围内，但针对B基因型标准血清，相对偏差基本位于0.20.3 lg IU/ml。,44,2种试剂盒之间精密度的差异无统计学意义。,45,2种试剂盒对HBV DNA低载量血浆样本检测的变异系数均显著高于高载量血浆(B基因型：P=0.0031；C基因型：P=0.00
19、05)。,46,临床血清盘： 共42份, 含5份HBV DNA阴性 (HBsAg和抗-HBc阴性) 和37份HBV DNA阳性 (Abbott RealTime HBV Test试剂盒检测判定) 不同滴度水平的血浆样本。分别用Roche、圣湘HBV核酸定量试剂盒检测，比较三者之间的符合率和特异性。,湖南圣湘和罗氏HBV DNA定量试剂盒对42份临床血清盘测定结果的比较分析,总符合率：97.62%,47,对37份阳性样本两种检测试剂的检测结果为显著相关,48,临床血清盘中有2个样本（编号236和283）Roche HBV试剂反复检测为阳性，但是低于20 IU/ml。用圣湘磁珠法试剂反复检测结果均
20、在10 IU/ml左右。 我们在圣湘公司试剂检测靶基因区域之外，设计了套巢式引物进行PCR扩增和克隆测序，同时严格设置阳性质控和阴性质控，把扩增产物送往测序公司进行克隆测序。 结果证实编号236和283两个样本的测序结果为HBV基因组序列，测序长度为258bp，与理论序列长度一致。克隆测序结果与HBV AH基因型标准序列进行进化树分析，证明均为C基因型，但分属于2个不同的亚簇。,49,湖南圣湘研发的国产新型试剂盒与罗氏试剂盒在溯源性、准确度、精密度等指标上无明显差异。 由于未能收集足够数量超高病毒载量的临床标本 (2.0108 IU/ml)，本研究未能对该2种试剂盒的线性范围进行严格的评价。 新型国产试剂盒在保存温度及时间方面尚有待改进 罗氏试剂盒为28，25个月；国产试剂盒为（-205），9个月）。 新型国产试剂在低病毒载量检测的稳定性仍有提高空间。,50,谢 谢!,