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1、X-linked Agammaglobulinemia BTK gene defect,Brief Introduction of XLA：,X连锁无兵种球蛋白血症（X-lingked agammaglobulinemia , XLA），又称Bruton无丙种球蛋白血症，是最早发现的人类原发型免疫缺陷病（pomary immunodeficiency disease ,PID）之一，临床上以反复细菌感染为特征，血清中各类免疫球蛋白明显降低或缺乏，对抗原刺激不能产生抗体应答，血循环中B 淋巴细胞减少，淋巴结及淋巴组织缺乏生发中心和淋巴滤泡，骨髓中无浆细胞，但前B 淋巴细胞数量正常，T淋巴细胞数量
2、及功能正常。,发病原因：,BTK属于非受体酪氨酸蛋白激酶，该类激酶泛参与细胞信号传导，影响细胞的存活、增殖和分化，BTK是B细胞发育成熟的关键因素、 正常人除T细胞和浆细胞外均有BTK表达，而BTK基因突变只影响B细胞的数量，这说明BTK存B细胞的生长发育过程中起着至关重要的作用。,The Struction of BTK Protein：,（Begin from N Terminal）,The number of amino acid,The location of each exon,Btk包含5个结构域：PH结构域(Pleckstrin homology domain)、TH结构域(Te
3、c homology domain)、SH3结构域(Src homology3 domain)、SH2结构域(Src homology2 domain)和催化结构域(Tyrosine kinase domain)这些结构域可以识别并结合多种信号分子，为Btk参与多种信号通路奠定基础PH结构域通过识别并结合膜磷脂的代谢产物磷脂肌醇三磷酸将Btk募集到细胞膜上，参与胞外刺激引发的信号转导7TH结构域由Btk motif和富含脯氨酸区域两部分组成，SH3结构域可特异识别TH结构域的富含脯氨酸区域，因此可以发生分子内部的折叠此外，SH3结构域还可与Syk/ZAP70等分子发生相互作用，这对下游的PKC
4、激活有重要作用。,BTK 突变的分子机制：,Btk是许多受体的信号传递所必需的，如B细胞抗原受体(BCR)、CD38、白介素一5受体(IL5R)和IL10R，并作为IL6和FcaRI信号传递途径的组成部分。而BCR对维持成熟B细胞的数量和对抗原的反应能力是必不可少的。当BCR被交联(crosslinking)后，Btk可以被激活。 目前已知，在Btk的信号传导途径中，涉及其上游的Btk激活分子和下游的Btk效应分子两部分: 作用于Btk的上游激活分子包括：(1)Src家族激酶。研究表明，当BCR交联后，最早发生的事件是激活Src家族激酶，后者可使Btk激酶区中的Y551酪氨酸残基位点磷酸化，导
5、致Btk激酶活性增高和SH3区的Y223酪氨酸残基位点自身磷酸化，进一步对下游效应蛋白产生作用。(2)作用于Btk PH区的协同激活分子。通过失功能或获得功能性突变已证明，Btk中的PH区是调节Btk活性的关键区域。结合在Btk PH区的多种蛋白和脂质配体包括异三聚体G蛋白的亚单位,这些分子与BtkPH区相互作用的结果，可促进Btl(的细胞膜定位，使Src家族激酶激活Btk。 此外，由于许多PH区的配体涉及G蛋白偶联受体(GPCR)信号，提示Btl(可作为GPCR信号途径的一个成分，与BCR协同或独立于B隙信号途径发挥作用。,BTK被上游激活分子激活后，可通过激活多个下游效应分子，发挥复杂的生
6、物效应，包括： (1)磷脂酶C(PLC)7激活、BCR介导的Ca2+内流和IP3释放。许多实验系统已经证实了Btk具有介导BCR诱导的Ca2+内流作用。BCR交联后可激活Btk，后者可激活PLCy。激活后的PLCy可引起IP，释放和随后的Ca2+内流。 (2)丝裂原激活蛋白(MAP)激酶通路的激活。Btk可激活C-Jun蛋白N端激酶(JNK)和P38。实验研究表明，在BCR缺陷的鸡红细胞或XID及Btk缺陷的鼠中，P38和卟K的活性下降。在Btk的信号通路中，P38和JNK的作用可能是参与调节BCR信号的阈值。 (3)细胞周期调节和凋亡。调节细胞生存和细胞周期的基因属于Btk信号通路的下游成分
7、。在XID鼠的B细胞中，BCR交联后对抗凋亡基因bclxl的诱导受损。此外，参与Btk信号通路的相关细胞周期蛋白包括odk2，Odk4，cyclins D2和A等。 (4)Btk底物及未知功能的结合伴侣分子。仍有大量的蛋白分子可以在体外与Btk的某些亚区结合，或与Btk免疫共沉淀，或依赖于Btk磷酸化。它们可能是Btk的调节分子或效应分子，但对其功能目前尚缺少直接的实验数据,BTK 突变的分子机制：,BTK基因拼接点突变致XLA的基因诊断：,流式细胞仪检测单核细胞BTK表达：采集患者及其家庭成员肝素抗凝的外周血，密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)。使用抗BTK单克隆抗体标记细胞内BT
8、K。流式细胞仪分析PBMc上的BTK表达。 基因组DNA 和cDNA 的制备及其PCR扩增： 每人抽取外周血5 ml(肝素抗凝)，按本实验室常规方法提取基因组DNA和RNA，逆转录合成eDNA。根据基因库(Genbank)中BTK 基因组DNA(序列号U78027)及mRNA(序列号X58957)的基因序列，自行设计了18对包括BTK基因19个外显子编码区和侧翼拼接点基因组DNA 的PCR引物，3对包括BTK mRNA全长的eDNA引物，进行21次PCR反应，每次反应用0.1/lg基因组DNA或eDNA作为模板。对扩增出的cDNA 片段(命名为F、M、B)进行琼脂糖凝胶电泳分析，比较其各片段的
9、大小。 DNA的PCR扩增和序列分析采用PCR直接测序法，用正义、反义两对引物进行双向测序。上述PCR反应产物经乙醇沉淀纯化后，分别以上述引物和含内含子侧翼的内引物，总共21对止义和反义测序引物，用测序试剂盒(PEApplied Biosystems)直接进行双向测序。所用PCR和测序引物。用ABI Prism 377全自动测序仪(测序。,BTK基因拼接点突变致XLA的基因诊断结论：,单核细胞上BTK蛋白的表达：流式细胞仪测得患儿单核细胞上的BTK蛋白表达为0，同龄对照、母亲和父亲分别为7242 、3067 、5868 。,BTK cDNA 片段电泳结果：电泳结果显示患儿BTKcDNA M 片
10、段的长度较其父母的长约81个碱基。,患儿父亲、患儿母亲、患儿的BTK cDNA F、M、B电泳分析,BTK基因拼接点突变致XLA的基因诊断结论：,BTK基因测序结果：患儿BTK基因全基因分析，发现内含子142位点碱基替换突变A G(IVS142，A G)。外祖母、母亲BTK基因内含子142位点碱基替换AG杂合突变，为携带者。父亲BTK基因正常。BTK mRNA基因分析基因，发现患儿外显子14与15之间拼接异常，分析到异常变大(多81个碱基)的mRNA。母亲、外祖母、父亲外显子14与15之间分析到正常大小tuRNA。这些测序结果与国际遗传免疫缺陷病数据库报道的BTK基因突变类型比较证实为新型的B
11、TK基因突变。,A：患儿BTK基因15外显子反向测序结果：内含子142位点碱基 替换突变AG(IVSI42，AG）； B：正常(父亲lBTK基因15外显子反向测序结果； C、D：分别为患儿母亲和外祖母的BTK基因15外显子反向测序结果BTK基因内含子142位点硷基替换AG杂合突变。为携带者； E：患儿BTK cDNA反向测序结果比正常BTK cDNA长81个碱基； F、G：分别为患儿父母BTK cDNA反向测序结果为正常的BTK cDNA,XLA的诊断,在年长儿或成人中，低水平的lgG(2L)和低水平或无IgA、IgM是XLA的典型表现”。 XLA患者血循环中缺乏成熟B细胞，可通过流式细胞攸测
12、定免疫荧光标记的CDl9和(或)CD20B细胞表达抗原此法对6十月前婴儿诊断尤为重要。 预防接种后抗体的检测：接种灭活疫苗后无或产生较弱的抗体；或注入新抗原，噬菌体, Xl74，可发现由于无抗体产生或抗体合成受抑而导致的抗原清除延迟。 Btk基因的突变分析是XLA的确诊实验,有关XLA产前检查,因为正常人血循环中的B细胞有两种，1种是来自母亲有活性的x染色体，另1种是来自父亲的有活性的x染色体；而携带者仅有1种来自父亲的有活性的x染色体来源母亲的x染色体是失活的X染色体失活型可以通过其甲基化型来检测，即通过连接XLA突变位点临近区多态性或研究杂合子选样性保留的有活性染色体来发现携带者。 通过检
13、测突变基因来发现携带者。用连锁分析的方法(如碰用DXSl78 作为分子探针)来直接分析。 产前分析包括连锁分析和羊水细胞和(或)脐血B淋巴细胞计数的方法。应用基阻序列分析发现携带者亦可为产前诊断提供重要信息,免疫球蛋白替代疗法（治标） IVIG; IMIG; alloBMT（治本）,治疗:,IVIG治疗XLA,其起始量一般为400600m/kg，然后根据患儿对治疗的反应束调整用药剂量及给药间隔和频率必领个体化，使免疫球蛋白维持在正常的上限水平； 一研究机构比较了不同剂量的IVIG与肌肉注射免疫球蛋白(IMIG)的疗效差别，结果显示每3周接受大剂量IVIG(400mg/kg)并保持血清IgG正常
14、或接近正常值低限(4g/L)组的患儿住院率、感染率较每3剧接受低剂量IVIG(200mg/kg)或IMIG明显减少。早期开始大剂量IVIG治疗的患儿其肺炎、化脓性脑膜炎及胃肠道感染的发生率明显降低。基于这些原困许多研究中心在婴儿期(生后后6个月)就开始IVIG治疗。,免疫球蛋白替代疗法（治标）,免疫球蛋白替代疗法缺陷：,尽管免疫球蛋白冶疗是XLA的重大进展，但它只能替代IgG而不能建立主动免疫；虽然IVIG可明显降低患儿感染的频率和严重程度，却不能杜绝感染。,allo-BMT（治本）,若不采用替代治疗，约有半数患者在10岁前死亡；采用丙种球蛋白替代治疗，费用昂贵且须替代终生。但是通过异基因骨髓
15、移植（allo-BMT）治疗免疫缺陷性疾病，可重建正常的免疫系统，目前为止是根治此病的唯一方法。,allo-BMT（治本）的讨论及预后,通过allo-BMT治疗免疫缺陷性疾病，可重建正常的免疫系统。可以弥补丙种球蛋白替代治疗的缺陷：治疗费用昂贵，且长期应用，患者的依从性差。后重建体液免疫多年健康存活，不再需要替代治疗，生活质量得到明显提高，因此allo-BMT治疗是有意义的。,预处理有的使用TBI方案，确保Bu有效血药浓度，会出现难以接受的不良反应。但多数是采用改良的BUCY方案，用Bu1620mg/kgCy200mg/kg。与这些预处理方案相比，我们采用的预处理方案中,Bu和Cy的量减少，但加用了抗CD3单抗，使得免疫抑制有特异性，因此本预处理方案的清髓作用及不良反应减低，但仍有足够的免疫抑制，可保证异体植活。,展望,尽管绝大部分BTK基因突变都可以通过流式细胞仪检测到BTK表达降低，但也有个别存在BTK基因突变的病例BTK表达正常。因此没有检测到BTK蛋白质表达的变化也不能完全排除存在突变的可能。,BTK基因的表现型和基因型关系的建立：,Thank You For Your Attention!,