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1、目标导航,预习导引,1.能正确选择材料对植物或动物组织中的DNA进行粗提取。 2.能说出DNA的物理、化学性质。 3.能记住DNA粗提取与鉴定的原理。,目标导航,预习导引,一,二,三,四,一、DNA的提取 1.提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言,就是要利用DNA与 RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异,提取DNA,去除其他成分。,目标导航,预习导引,一,二,三,四,2.DNA粗提取的原理 (1)DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,利用这一特点,选择适当的盐浓度就能
2、使DNA充分溶解,而使杂质沉淀,或者相反,以达到分离目的。 在物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中,DNA的溶解度最小。 此外,DNA不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些蛋白质能溶于酒精溶液。利用这一原理,可以将DNA与蛋白质进一步分离。 (2)DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解蛋白质,但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受6080 的高温,而DNA在80 以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜,但对DNA没有影响。,目标导航,预习导引,一,二,三,四,二、DNA的鉴定 在沸水浴的条件下,DNA与二苯胺反应呈现蓝色,因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,目标导航,预习导引
3、,一,二,三,四,三、实验设计 1.实验材料的选取 原则上,凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是,选用 DNA含量相对较高的生物组织,成功的可能性更大。 生活在牧区的人们,采集牛、羊和马血比较方便,他们用牛、羊、马血作为提取DNA的实验材料合适吗?为什么? 提示:不合适。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核,而DNA主要存在于细胞核中,血液中白细胞和淋巴细胞数目少,因此DNA含量少,在实验中很难提取到。,目标导航,预习导引,一,二,三,四,2.破碎细胞,获取含DNA的滤液 动物细胞的破碎比较容易,以鸡血为例,在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水,同时用玻璃棒搅拌,过滤后收集滤液即可。如果实验材料
4、是植物细胞,需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如,提取洋葱的DNA时,在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐,进行充分的搅拌和研磨,过滤后收集研磨液。 为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂? 提示:鸡血细胞在蒸馏水中会发生渗透吸水,以致破裂。,目标导航,预习导引,一,二,三,四,3.去除滤液中的杂质 最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质,需要进一步提纯DNA。 方案一:利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同,在滤液中加入NaCl,使NaCl溶液物质的量浓度为2 mol/L,过滤除去不溶的杂质;再调节NaCl溶液物质的量浓度为 0.14 mol/L,析出DNA,过滤去除溶液中的杂质;再用物质
5、的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA。 方案二:利用蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA的特点,在滤液中加入嫩肉粉,嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。 方案三:利用蛋白质和DNA的变性温度不同的特点,将滤液放在 6075 的恒温水浴箱中保温1015 min,过滤获得DNA滤液。,目标导航,预习导引,一,二,三,四,4.DNA的析出与鉴定 将处理后的溶液过滤,加入与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液(体积分数为95%),静置23 min,溶液中会出现白色丝状物,这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分。 取两支20 mL的试管,各加入物质的量浓度为2
6、mol/L 的NaCl溶液5 mL,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入4 mL 的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热5 min,待试管冷却后,比较两支试管中溶液颜色的变化,看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。,目标导航,预习导引,一,二,三,四,四、操作提示 1.以血液为实验材料时,每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠,防止血液凝固。 2.加入洗涤剂后,动作要轻缓、柔和,否则容易产生大量的泡沫,不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 3.二苯胺试剂要现配现用
7、,否则会影响鉴定的效果。,知识梳理,典例透析,一,二,一、DNA粗提取的原理,知识梳理,典例透析,一,二,知识梳理,典例透析,一,二,二、实验成功的关键及注意事项 1.实验材料选用鸡血细胞液,而不用鸡全血的主要原因是遗传物质DNA主要存在于血细胞的细胞核内。 2.盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。玻璃表面带电荷,鸡血细胞破碎后释放出的DNA中的磷酸基也带电荷,因而容易被玻璃容器吸附,提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,以减少提取过程中DNA的损失。 3.破碎细胞释放DNA过程中,若实验材料是血细胞,加水后必须充分搅拌,否则血细胞核不会充分破碎,溶解出的DNA量
8、就会减少;若实验材料是植物细胞,需先用洗涤剂溶解细胞膜。,知识梳理,典例透析,一,二,4.洗涤剂是多组分的混合物,在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DNA时,通常使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)或吐温等化学试剂。 5.实验过程中两次加入蒸馏水,操作目的各不相同:第一次向鸡血细胞液中加蒸馏水,目的是使血细胞通过吸水涨破,释放出核内的DNA。第二次向溶有DNA的滤液中加蒸馏水,目的是稀释NaCl溶液,使其物质的量浓度降至0.14 mol/L,最终使大量DNA析出。 6.实验过程中几次过滤的目的:破碎鸡血细胞后过滤的目的是除去破裂的细胞膜等物质;将溶有DNA
9、的高浓度NaCl溶液过滤的目的是除去不溶于高浓度NaCl溶液的杂质;用低浓度NaCl溶液析出DNA后过滤的目的是除去溶于低浓度NaCl溶液中的杂质。 特别提醒过滤时采用单层纱布或尼龙布,不能使用滤纸,以减少DNA的损失。,知识梳理,典例透析,一,二,7.析出的DNA丝状物用玻璃棒搅拌时,要缓缓沿一个方向搅拌,而且不能直接触碰烧杯壁,以便获得较完整的DNA分子。 8.用冷酒精浓缩和沉淀DNA时,所用的体积分数为95%的酒精必须充分预冷后才能使用,冷酒精与含有DNA的NaCl溶液的体积比是11。 特别提醒低温可抑制核酸水解酶的活性,防止其降解DNA;低温可降低分子的运动,DNA易于形成沉淀析出;低
10、温有利于增加DNA分子柔韧性,减少断裂。 9.粗提取所得的丝状物的主要成分是DNA,可用二苯胺作为鉴定试剂。若出现蓝色,说明实验基本成功;如果不出现蓝色,可能是因为所提取的DNA含量低,或是实验操作中出现错误。,知识梳理,典例透析,题型一,题型二,题型一 DNA提取、分离与鉴定原理 【例题1】 现代生物学已向两个方面发展,宏观研究的水平为生态系统水平,微观研究的水平为分子水平,对于分子的研究,其物质的提取和分离显得尤为重要。下面是关于DNA分子的提取和分离的相关问题,请回答下面的问题。 (1)在提取菜花细胞中的DNA时,采用的是研磨法,为什么不能像鸡血那样,用蒸馏水使其破裂? (2)在提取实验
11、过程中用到两种浓度的NaCl溶液,说明其作用。 物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液: 。 物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液: 。 (3)以血液为实验材料时,每100 mL血液中加入3 g柠檬酸钠的作用是 。 (4)鉴定DNA所用的试剂是 。,知识梳理,典例透析,题型一,题型二,解析:(1)DNA分子提取中理想的材料为富含DNA的细胞,鸡血红细胞具有细胞核,放入蒸馏水中细胞会涨破释放出DNA,而植物细胞中含有细胞壁,需要用研磨法破坏细胞壁。 (2)实验过程中用到两种浓度的NaCl溶液,物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液用于溶解DNA,而物质的量浓度为0.14 mo
12、l/L的NaCl溶液会使DNA析出。 (3)为了防止血液凝固,应加入柠檬酸钠。 (4)鉴定DNA所用的试剂为二苯胺试剂。 答案:(1)植物细胞具有细胞壁,不会吸水涨破,只有加入洗涤剂和食盐进行充分的研磨,才能释放出DNA。 (2)溶解DNA分子,过滤并除去不溶于该浓度NaCl溶液的杂质 使DNA分子析出,过滤并除去溶于该浓度NaCl溶液中的杂质 (3)防止血液凝固 (4)二苯胺试剂,知识梳理,典例透析,题型一,题型二,题型二 DNA粗提取与鉴定实验中的操作 【例题2】 下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是( ) A.酵母和菜花均可作为提取DNA的材料 B.DNA既溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸馏水 C.向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌,可见玻璃棒上有白色絮状物 D.DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热,冷却后呈蓝色 解析:本实验可选含有DNA的生物材料,A项正确;DNA在物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液和蒸馏水中溶解度较大,在物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最小,呈白色絮状,B项正确,C项错误;鉴定DNA的方法是在DNA溶液中加入二苯胺试剂,并沸水浴加热,冷却后呈蓝色,D项正确。 答案:C,