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1、到目前为止， 几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖 都与微生物学有关,微生物的类群,原生生物：,原核生物:,真菌:,病毒:,如酵母菌,单细胞的动植物,如草履虫、单细胞藻类等,无细胞结构,细菌、蓝藻,原核细胞,课题1 微生物的实验室培养,专题2 微生物的培养与应用,1.提供营养和条件,2.防止污染,一.培养基：,微生物生存的环境和营养物质,1.基本成分：,思考：微生物“吃”什么？,碳源、氮源、水、无机盐,碳源,无机碳源：,有机碳源：,CO2、CO32-、HCO3-,牛肉膏、蛋白胨等,自养微生物,异养微生物,氮源,无机氮源：,有机氮源：,NH4、NO3-（为硝化细菌提供N源和能源）,牛肉膏、蛋白
2、胨、酵母膏、尿素等,注：含CHON的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源,一.培养基：,微生物生存的环境和营养物质,1.基本成分：,碳源、氮源、水、无机盐,2.特殊营养：,维生素、碱基等（生长因子）,（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）,3.pH、氧气的需求：,4.种类：,固体培养基,液体培养基,有无 凝固剂琼脂,分离 鉴定,工业 生产,化学成分：,物理性质：,天然培养基 合成培养基,牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。,分析营养构成？,5. 配制原则,目的明确：,营养全面、浓度适宜、比例恰当,适宜的pH值：,有机碳源,异养型：,根据微生物的种类、培养目的选择原料,自养
3、型：,不加碳源,加入缓冲剂,细菌偏碱，真菌偏酸,（CO2碳源）,耐高温需保持干燥的 物品，160170 12小时,接种环、接种针等 金属用具,7075、30min 80、15min,100、56min,较为温和理化方法，,杀死部分有害菌体,（不包括芽孢、孢子）,强烈的理化方法，,杀死所有微生物,（包括芽孢、孢子）,煮沸消毒法,巴氏消毒法,化学药剂,紫外线,灼烧灭菌,干热灭菌,酒精、氯气、石炭酸等,高压蒸汽灭菌,培养基， 100KPa、 121、1530min,二.无菌技术：,防止外来杂菌的污染,1.消毒与灭菌：,请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培
4、养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手,思考,2.无菌范围：,实验操作空间消毒,操作者的手、衣着消毒,实验用具灭菌,实验操作过程,酒精灯旁操作,超净工作台,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌,孢子,细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的生殖细胞。能直接发育成新个体。,单个 或少数菌体,2.特征：,大小、形状
5、、光泽度、 颜色、透明度等。,3.功能：,1.定义：,菌落,鉴定菌种的重要依据,固体培养基上,大量繁殖,子细胞群体,三.大肠杆菌的纯化培养：,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.计算：,培养基用量,依配方计算各成分的用量,2.称量：,3.溶化：,牛肉膏黏稠，用称量纸称取,牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖,牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解,取纸,蛋白胨、NaCl,琼脂,补水定容,4.调pH、分装、封口：,5.灭菌：,6.倒平板：,培养基、培养皿,分散成单个细胞,形成单个菌落,倒平板,约50,防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染,灼烧灭菌， 防止瓶口的微生物污染培养基,1.培养基灭菌后，需要冷却到50
6、 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培
7、养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,二.大肠杆菌的纯化培养：,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,纯化大肠杆菌：,平板划线法：,菌种,划3个平板,1个不划线,1.纯化大肠杆菌的方法：平板划线法和稀释涂布平板法,接种环,防止划破培养基,（重复实验）,（空白对照）,平板划线法,平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。,问题讨论,1、为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种
8、环上可能存在的微生物污染培养物,杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。,及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,6支试管，分别加入9ml无菌水,101,1
9、02,103,104,105,106,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,菌液,微量 移液器,浸,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,b.涂布平板：,不超过0.1ml,各梯度分别涂布3个平板,1个不涂布作空白对照,滴,灼,涂,稀释涂布法,稀释涂布法是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。,问题讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。 例如：酒精灯与培养皿的距离要合适、 吸管头不要接触任何其他物体、 吸管要在酒精灯火焰周围等等。,3
10、平板划线法和稀释涂布平板法的比较,平板划线法：,稀释涂布平板法：,2.培养：,将接种后的培养基和一个未接种的培养基,放入37恒温箱中培养12h24h后，,观察并记录,（三）菌种的保藏：,1.临时保藏：,试管固体斜面培养基上，培养长成菌落,4冰箱保存,2.长期保存：,菌种易被污染、变异,甘油管藏,1ml甘油（灭菌）1ml菌液,20,搁置斜面,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。 （二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说
11、明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。 （三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。,微生物的培养,基础 知识,实验操作,结果分析与评价,培养基,定义：,分类：,人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养物质,固体培养基,液体培养基,无菌技术,培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法,定义：,消毒与灭菌,常用灭菌方法,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,纯化大肠杆菌,试,