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1、深圳市人民医院病理科 分子实验室 姜阳阳 2015-10-27,肿瘤分子检测方法与质量控制,医学发展历程的启示,经验医学,循证医学,精准医学,诊断靠治疗后期经验积累。,诊断治疗以人群、科学研究证据指导临床实践。,诊断治疗以个体为基础，更加提前、具体与精确。,分子时代,肺腺癌：EGFRKRASBRAFALK-ROS1RET等检测已是共识； 肺鳞癌发生模式不同，检测靶标以扩增为主，同时EGFR、ALKROS1某些病例也有必要检测。,我们可以用的分子生物学手段：,实时荧光PCR方法（扩增阻碍突变系统法（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、PC
2、R-高分辨溶点曲线分析（HRM）、数字PCR等） PCR-杂交法（膜上、芯片基因芯片 、乳胶颗粒Luminex） PCR-Sanger测序 PCR-焦磷酸测序 新一代高通量测序 PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等 荧光原位杂交（FISH） 直接杂交 免疫组化,分子病理检测的主要方法,检测技术,检测对象,检测基因,检测水平,EGFR，KRAS，BRAF， BRCA, BCR-ABL，JAK2,EML4-ALK，ROS1，HER2， RET,BRCA1，TOP2A，TYMS,EGFR，EML4-ALK， HER2,是RT-PCR平台上的特异扩增技术（易开展） 共发表300多篇文献 著名的大型
3、临床研究 - 如IPASS、INFORM等,国际肺癌协会专家共识 中国基因突变检测专家共识 日本临床专家共识,ARMS技术 被临床证明的肿瘤基因突变检测技术,DNA 基因重排,融合mRNA或5/3 mRNA差异表达,嵌合蛋白表达,肺癌中ALK基因变异的表达调控,FISH/CISH NGS,RT-PCR 5/3比较qRT-PCR RACE-PCR ,IHC,荧光原位杂交技术（FISH）,2个信号分离直径的要求，使实际应用中结果难以判断 有5-11%出现假阳性信号分离1，2，3 工作强度大，费时 主观性强，受人为因素影响大,横向,纵向,1. FISH技术是美国药物临床试验中所采用的检测方法。 2.
4、 采用“分离”分析，基因倒位和ALK重排后，红色和绿色探针分开 3. 15%的样本细胞中呈现分开的红色和绿色信号表示阳性结果1,操作简单，时间短 结果客观，易于判读，减少人为因素的影响 除FFPE样本外，还适用其他类型样本组织1 与EGFR、RET、ROS1等其他检测不冲突，共用相同组织切片和PCR扩增程序，节约有限资源和时间 中国荧光PCR仪器普及率更高，更加适合国情,实时逆转录法（Real Time-PCR）,CFDA批准的基因检测产品,基于Real Time-PCR方法检测驱动基因的分子诊断产品获得CFDA批准最多,2-3 片FFPE样品 同时将DNA和RNA分离出来 同时获得EGFR、
5、ALK和ROS1检测结果,节约样本、节约时间、节约成本,DNA/RNA,EGFR突变型,ALK阳性 或ROS1阳性,EGFR野生型 ALK阴性 ROS1阴性,吉非替尼 厄洛替尼 埃克替尼 阿法替尼,克唑替尼 色瑞替尼,其他治疗方式,DNA/RNA共分离剂盒,EGFR/ALK+ROS1,2.5小时PCR,4.5小时,FFPE切片1-3片 或活检小标本,2015 NSCLC NCCN指南,对于NSCLC患者建议检测EGFR和ALK基因状态； 对于ROS1/MET/RET/BRAF/ HER2等崭露头角的靶基因也给予关注,1.室内质量控制 2.室间质量评价,分子病理实验室的质量控制,1.建立标准化的
6、实验室 2.具备资质且相对固定的人员 3.性能稳定的试剂 4.持续不断的学习和开展质控,医疗机构临床基因扩增检验室管理办法（卫办医政发2010194号） 医疗机构临床基因扩展检验实验室工作导则（卫办医政发2010194号）,FISH实验区,临床基因扩增实验室 标准化操作文件（sop）,1.写你所做 2.做你所写 3.实验室的精髓,可操作性的sop文件,人员资质,理想的试剂,试剂方法的性能验证及每批试剂的质检 性能指标： 重复性（精密度） 准确性（定量：回收率、标准物质等；定性：方法学比较等） 线性范围（定量） 分析特异性 测定下限 抗干扰能力,资质认证 试剂质量 试剂反应性能 前后批号结果一致
7、性 测定下限 批内变异（10%)和批间变异（15-25%),你其实做了这些，但是你有记录么？,1.日常维护 2.定期保养 3.维修记录,实验室最忠实的员工-仪器,全流程：标本接收-石蜡切片-核酸提纯-实时荧光定量PCR扩增-结果分析 分析前：标本接收、制片、填写检测申请单 分析中：核酸提取、扩增、产物分析、检测有效性判断 分析后：结果分析、报告审核、结果解释 标准：重复，可控，规范,全流程室内质控,DNA模板质量更重要，建议对提取的DNA模板进行质量检测： OD260/OD280=1.80.2， OD260/OD2301.7,全流程室内质控,积极参加各级室间质量评价,1.深圳市病理质控中心 2.广东省临床病理质控中心 3.卫生部临床检验中心 4.有条件可参加更多检测机构（PQCC、EMQN、CAP等）,Thank You !,敬请各位专家提出宝贵意见,