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1、基因工程原理与方法,基因操作、基因重组、基因工程 基因克隆、分子克隆,First, restriction endonucleases cleave DNA at specific sequences to generate a set of smaller fragments. Second, the DNA fragment to be cloned can be isolated and joined to a suitable cloning vector using DNA ligase to seal the DNA molecules together.,基因操作常用技术,一、宿
2、主与质粒、感受态的制备 二、重组质粒的提取 三、基因工程载体 四、DNA的酶切 五、DNA片段的回收 六、 DNA片段与载体的连接 四、基因克隆策略 五、重组DNA的鉴定 六、基因组与RNA的提取 七、文库构建 八、核酸探针 九、DNA序列测定 十、基因定点突变 十一、基因表达,基因工程的基本过程,目的基因的获得 载体的酶切 目的基因与载体的连接 连接物转化大肠杆菌 转化子的筛选 重组质粒的鉴定,工具酶及其应用,分子生物学中常用的工具酶有限制性内切酶、DNA连接酶、Rnase A、碱性磷酸酶、DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激、核酸酶,一限制性内切酶与连接酶,Restriction endonuc
3、leases & ligase 能识别并切割dS-DNA分子内特殊核甘酸序列的酶称为限制性核酸内切酶。,1952午Luria和Human在研究T偶数噬茵体及1953年Bertani和Weigle在研究和P2噬菌体的宿主范围时发现:当一个噬茵体从其天然宿主E. coli品系A转到另一个品系B细胞中时，往往不能生长。他们把此现象称为宿主控制性限制现象 1962年，Arber及其同事们作了大量工作，经过放射性同位素标记证明，噬菌体在新品系中的损害伴随有其DNA的降解，但宿主自己的DNA并不降解，他们提出了限制-修饰酶假说来解释这种现象。,细菌的限制与修饰系统,Restriction endonucl
4、eases are found in a wide range of bacterial species. Werner Arber discovered that their biological function is to recognize and cleave foreign DNA (e.g., the DNA of an infecting virus); such DNA is said to be restricted. The cells own DNA is not cleaved because the sequence recognized by the restri
5、ction endonuclease is methylated (and thereby protected) by a specific DNA methylase. The restriction endonuclease and the corresponding methylase in a bacterium are sometimes referred to as a restriction-modification system. There are three types of restriction endonucleases, designated I, II, and
6、III. Types I and III are generally large, multisubunit complexes containing both the endonuclease and methylase activities. Type I restriction endonucleases cleave DNA at random sites that can be 1,000 base pairs or more from the recognition sequence. Type III enzymes cleave the DNA about 25 base pa
7、irs from the recognition sequence. The type II restriction enzymes, first isolated by Hamilton Smith, are simpler, require no ATP, and cleave the DNA within the recognition sequence itself?The extraordinary utility of the type II enzymes was first demonstrated by Daniel Nathans, and these are the en
8、zymes used most widely for recombinant DNA work.,More than 800 restriction endonucleases have been discovered in different bacterial species. Over 100 different specific sequences are recognized by one or more of these enzymes. These sequences are almost always short (four to six base pairs, occasio
9、nally more) and palindromic,Some restriction endonucleases cleave both strands of DNA so as to leave no unpaired bases on either end; these ends are often called blunt ends . Others make staggered cuts on the two DNA strands, leaving two to four nucleotides of one strand unpaired at each resulting e
10、nd. These are referred to as cohesive ends or sticky ends. because they can base-pair with each other or with complementary sticky ends of other DNA fragments.,常用限制性内切酶(RE),(一)产生3凹端的RE BamH:G GATCC EcoR :G AATTC Hind : A AGCTT Sal : G TCGAC Xba : T CTAGA Xho : C TCGAG,BamH: G GATCC NNNGGATCCNNN NNNC
11、CTAGGNNN BamH NNNG GATCCNNN NNNCCTAG GNNN,(二)产生3凸端的RE Kpn : GGTACC Pst : CTGCAG NNNGGTACCNNN NNNCCATGGNNN Kpn NNNGGTAC CNNN NNNC CATGGNNN,三、产生平端的RE EcoR: GAT ATC Sma:CCC GGG NNNNGATATCNNNN NNNNCTATAGNNNN EcoR NNNNGAT ATCNNNN NNNNCTA TAGNNNN,限制酶活性单位的定义：在限定的温度和缓冲液下，1小时消化1gDNA所需要的酶量。 多数RE在37时活性最高，因此，酶切
12、地般在37 消化，但少数RE例外，如Sma则在30时活性最高,如何进行限制酶切反应 DNA的酶切反应一般总反应体积常用20l，DNA量用0.1-1.0 g。在一微量离心管中分别加入以下反应组份 1、10反应Buffer2 l 2、DNA. 0.1-1.0 g 3、限制酶2-5 4、水补至20l 将上述各组份混匀后，置适当温度(多为37 )作用1-4小时，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定. 注意：由于目前RE价格大幅度下降，多数情况下均是超量用酶。如大部分RE的浓度在10-15 /l, 对于一般的酶切鉴定Promega公司推荐用0.5l，而TaKaRa公司推荐用1l，这均已大大超过实际所需用量,Summa
13、ry animation of the running of an agarose gel,DNA酶切注意事项 1. 市售RE酶均保存在含50%的甘油储藏Buffer中，甘油在酶切反应中浓度过高，对酶切效率有抑制作用，所加酶量不能超过反应总体积的1/10，特别注意控制在多个酶切反应中酶的总量。 2. 目前，在DNA的酶切反应中，往往超量使用酶。市售RE酶的浓度多数为10 / l。以前，RE特别昂贵，多取0.1 l RE进行小量DNA的酶切鉴定。目前，价格已大大降低，可不必如此经济。如TaKaRa公司酶的说明书要求小量DNA的酶切鉴定用1 l 每个反应， Promega则要求0.5 l 每个反应
14、。理论上每个反应用0.1 l即可切得很好。实际工作中每3-5个反应用1 l 酶是完全可靠的。,DNA酶切注意事项,3. 每一RE生产厂家均有其酶切反应Buffer种类，一般以10浓度提供：如Promega公司的A、B、C、D、E、K、M Buffer，TaKaRa公司的L、M、H、K Buffer。MBI公司的B、G、O、R Buffer。每种Buffer均用固定颜色盖的小管分装。酶有多种，但Buffer只有4-8种，装酶的小管盖的颜色与相应装Buffer小管盖的颜色一致。 4. 双(多)酶切Buffer的选择：相同Buffer；不同Buffer的酶切 5. 选择酶的一个经验：同一厂家越便宜的
15、酶其质量和性能越有保证，因质量和性能好的酶大家用得多，其价格自然便宜。 6. 在多数情况下，一个小时可将DNA切割完全，如若超过2个小时还切割不完全，在酶的质量没有问题的前提下，一般是质粒DNA的纯度不够， 有时用酚-氯仿提抽可解决问题，但多数情况下进一步纯化质粒DNA往往达不到目的(原因不明)，明智的选择是重新提取和纯化质粒。,DNA ligase,1、T4 DNA ligase 催化DNA分子的5-P与3-OH之间形成磷酸二酯键。它既能连接粘性末端，又能连接平端，但连接粘端的效率比平端的要高得多。其连接活性多数厂商用Weiss单位()表示, 浓度 一般是1-3 / l。在多数情况下对于DN
16、A重组来说，平端用1 ，而粘端用0.1 即可达到有效连接DNA分子的目的。 2. 大肠杆菌DNA连接酶：一般只能连接粘性末端，不能连接平端，很少使用。,DNA分子的连接：将待克隆的目的DNA片段与载体分子用DNA ligase连接成一个完整的分子。一般重组克隆时载体量用5-10ng即可，外源片段与载体的分子比不低于3，最好在10以上。典型的连接反应是： Buffer 1l或5l 载体 x l 目的DNA片段 x l ligase 0.5-1(单位) 水加至 10l 连接温度为4、16 ，时间 1-12小时不等，按ligase的说明书进行操作即可 注意：如果为粘端连接，应先将载体、目的DNA片段
17、及水先加入到小管中，混匀后置45 、作用5分钟，然后放入冰水中，再加入酶与buffer.,分子生物学其它常用酶,1、Klenow片段 NNGGATCCNNNNNNNNNNCTGCAGNNN NNCCTAGGNNNNNNNNNNGACGTCNNN BamH+Pst GATCCNNNNNNNNNNCTGCA GNNNNNNNNNNG Klenow+dNTP GATCCNNNNNNNNNNC CTAGGNNNNNNNNNNG Klenow用于补平限制酶切割DNA产生的3凹端和削平 3凸端，但后一 作用已被T4噬菌体DNA聚合酶所代替,2、 T4多聚核苷酸激、碱性磷酸酶 T4多聚核苷酸激用于连接但缺乏
18、5-P基团的DNA片段进行磷酸化、碱性磷酸酶的作用恰恰相反，它用于除去DNA分子的5-P基团，以阻止酶切后DNA载体的自身环化。 注：为降低基因克隆的背景，提高转化子的阳性率，常用碱性磷酸酶除去DNA载体酶切后的5-P基团。但这一目的通过提高外源基因片段与载体的分子比例可很好达到这一目的。,基因质粒载体,基因工程载体有质粒、噬菌体、酵母质粒以及病毒载体。其中质粒载体是DNA最基本的运载工具，也是最早建立起来的基因载体系统，而其它工程载体的构建及应用均离不开质粒载体。 质粒是细胞染色体外能独立复制的一种环状双链DNA分子，大小从1kb到200kb不等，广泛存在于多种细菌中，少数蓝藻、真菌和绿藻中
19、也存在有质粒。基因质粒载体是从自然界中存在的质粒经改造后构建而来的，主要分为克隆载体和表达载体两种，而后者又可分为原核表达载体和真核表达载体。,质粒的性质 1、质粒的复制与拷贝数 严紧型质粒和松弛型质粒 目前常用质粒载体的复制子与拷贝数,质粒的性质,2、质粒的不亲和性 3、质粒的转移 接合型质粒(tra+)、非接合型质粒(tra-) 4、质粒的表型： 有的质粒赋于宿主细胞一定的生物性状，如抗性质粒(R质粒)、产大肠杆菌素的Col质粒、引起细菌接合的育性质粒(F质粒)、降解毒物的降解质粒。 R质粒的抗性有：氨苄青霉素(Ap or Amp)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(Km Kan)、四环素(Tet
20、 or Tc)和新霉素(Neo)等,构建质粒载体的条件 1、复制子与质粒的拷贝数 2、选择标记：抗性基因。基因工程载体用得最多的Amp抗性基因、其次是Kan抗性基因，还有少量的Cm和Tc抗性基因。 3、分子量大小：2-10kb 4、尽可能多的单一限制酶切位点: MCS,pBR322由三部份构成：pRSF2124的Amp基因，pSC101的Tet基因、pMB1的复制子(与Col E1类似)。Amp与Tet基因上有多个单一限制酶位点，外源基因插入其中可引起抗性的插入失活,克隆载体,克隆载体 pUC18/19,pUC系列载体由pBR322的Amp基因、复制子和lacZ基因(来自M13mp质粒)组成，
21、 lacZ基因内有一由多个限制酶位点组成的DNA片段(多克隆位点，MCS)。pUC分子量较小，缺失了pBR322中控制质粒复制的rop基因，因而有较高的拷贝数，每子细胞中可高达500-700个分子。,克隆载体 pUC118/119,pGEM-3Zf(+),pGEM系列载体与pUC，同样为分子量小，拷贝数高的质粒，也有lacZ基因，主要不同处是MCS两端的启动子和单链复制子不同，也提供了不同的MCS,pGEM-3Zf(-),pGEM-5Zf(+),pGEM-5Zf(-),pGEM-T vector,pPoly2/sfinot,pPoly2/sfinot为一很小的质粒，可克隆较大的基因片段,表达载
22、体,在克隆载体的基础上发展而成。在克隆载体的适当位置插入与原核 或真核表达有关的元件(启动子、终止子)，并且在启动子与终止子之间有合适的MCS，即构建成了表达载体。表达载体一般要求有强的启动子和强的终止信号，有的还含有增强子。一些特殊用途的表达载体还有其它一些功能元件，如：调控序列、信号肽、跨膜区、定位表达等。 真核表达载体除有原核抗基因外，不少载体还有其它抗药性基因，这些基因的表达产物使转染细胞获得抗某些药物的能力。如：新霉素(Neo)、潮素(hygro)、dhfr(氨甲蝶呤),原核表达载体 pET-28a(+),原核表达载体 pET-28a(+),原核表达载体 pET-28(+),原核表达
23、载体 pBV220,pBV220为我国科学家张智清构建，为温控型原核表达质粒，在我国已广泛应用,原核表达载体 pEZZ18,pEZZ18在MCS的上游有SPA的分泌信号序列，为一分泌性原核表达载体,真核表达载体 pcDNA3.1,pcDNA3.1含有CMV立即早期启动子与增强子、牛生长激素基因的终止信号，及Neo抗性基因。转染有该质粒的细胞在G418 (Neo类似物)的作用下能存活，而未转染的细胞则死亡，据此，可克隆得到稳定表达外源基因的细胞系。,真核表达载体 pIRESneo,pIRESneo含有CMV立即早期启动子与增强子、牛生长激素基因的终止信号，及Neo基因、提高mRNA稳定性的内含子
24、IVS和核糖体进入位点(IRES)。IRES的存在可使同一mRNA分子上的2个ORF得以有效翻译。在抗性基因与外源基因分别由不同的启动子控制的表达载体中，由于外源基因丢失后，并不影响抗性基因的表达，此类型的载体转染的细胞在G418的作用下存活下来的约60%的细胞不表达外源基因。而该载体转染的细胞在G418的作用下存活的细胞大部份均表达外源基因。,真核表达载体 pVAX1,为一结构简单的真核表达质粒，FDA同意其作为基因疫苗的载体,表面呈现真核表达载体 pDisplay,该载体与pcDNA3结构类似。在其MCS的上游有引导分泌的信号肽序列，在MCS的下游有PDGFR基因的跨膜区结构域，该结构域编
25、码的多肽将表达的外源蛋白锚定在细胞膜上。,真核表达载体pGFP-C1,该载体与pcDNA3.1结构类似。在MCS的上游有绿色荧光蛋白(GFP)的基因序列，外源基因插入GFP的下游形成融合表达。可用于研究基因的表达定位。,pCI Vector,该载体与pcDNA3结构类似。在紧跟CMV启动子的下游有CMV立即早期基因的第一个内含子，该内含子可提高外源基因的转录水平。,pCI-neo Vector,pACT Vector,一些特殊的载体,一、染色体定位整合载体：基因整合平台系统(gene integration platform system).包括2个部分： 整合平台：受体细胞基因组上特定的一个
26、DNA区域，是外源DNA定位整合的位置 定位整合克隆载体：除与一般质粒载体所需要的元件外，还有一个或2个与整合平台区域同源的DNA序列。 利用基因整合平台系统转基因的方法也称为基因打靶(gene targeting)或基因定位同源重组,、内源平台双交换置换克隆载体系统,外源平台双交换置换克隆载体系统,、内源平台双交换插入克隆载体系统,、内源平台单交换插入克隆载体系统,二、人工染色体克隆载体,人工染色体克隆载体是一种“穿梭”载体，含有质粒克隆载体所必须的第一受体(E.coli)源质粒的复制子(ori),还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和自制起始位点的序列。该类载体在E.coli
27、中可按质粒形式进行高拷贝复制，当与目的基因连接后，转化第二受体细胞，在转化的细胞中的按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。 特点：可容纳1000kb 甚至3000kb的DNA片段 类型：BAC、YAC,三、组织特异性表达载体,在高等真核生物中，一些特殊的DNA调控序列(启动子)可调控基因只在一定的组织中才进行有效的表达。选用这样的启动子可以构建一系列组织特异性表达载体 1、乳腺表达载体 2、肿瘤细胞特异性表达载体，如Her2 3、植物：花药与种子特异性表达载体,待克隆基因的获得,基因克隆是将不同的目的基因与载体相连接，组装成一个新的DNA分子。目的基因的获得有如下几种方式 1、从含有目的基因
28、的质粒上酶切得到，此谓亚克隆 2、PCR or RT-PCR( 反向 PCR、锚定 PCR)：引物设计 3、人工合成：无合适的生物样品、或优化基因结构 4、基因文库： 5、cDNA文库：,待克隆基因的获得,基因克隆是将不同的目的基因与载体相连接，组装成一个新的DNA分子。目的基因的获得有如下几种方式 1、从含有目的基因的质粒上酶切得到，此谓亚克隆 2、PCR or RT-PCR( 反向 PCR、锚定 PCR)：引物设计 3、人工合成：无合适的生物样品、或优化基因结构 4、基因文库 5、cDNA文库,待克隆基因的获得,基因克隆是将不同的目的基因与载体相连接，组装成一个新的DNA分子。目的基因的获
29、得有如下几种方式 1、从含有目的基因的质粒上酶切得到，此谓亚克隆 2、PCR or RT-PCR( 反向 PCR、锚定 PCR)：引物设计 3、人工合成：无合适的生物样品、或优化基因结构 4、基因文库 5、cDNA文库,待克隆基因的获得,基因克隆是将不同的目的基因与载体相连接，组装成一个新的DNA分子。目的基因的获得有如下几种方式 1、从含有目的基因的质粒上酶切得到，此谓亚克隆 2、PCR or RT-PCR( 反向 PCR、锚定 PCR)：引物设计 3、人工合成：没有或无合适的生物样品、或需要优化 基因结构 4、基因文库 5、cDNA文库,文库一般用于克隆未知基因或寻找不同生物间的功能类似基
30、因,PCR克隆基因应考虑的一些因素,关于酶切位点的保护性基因 读码框架 序列测定 高保真DNA聚合酶 基因表达：信号肽、跨膜区,目的基因与载体的连接,连接方式有以下3种：全同源的粘端连接、平端连接和定向克隆，前两者为非定向克隆。全同源的粘端连接一般为同一个限制酶酶切载体和目的基因所进行的2个DNA分子的连接，但也有少数一些酶，它们虽认识并切割不同的DNA序列，但形成的粘端相同(匹配末端)，这也是全同源的粘端连接，不过这样连接形成的重组子不能被其中任一限制酶所切割。常见的有： 1、BamH:GGATCC-Bgl: AGATCT-Bcl : TGATCA 2 、Spe : ACTAGT-Xba :
31、TCTAGA-Nhe : GCTAGC 3、Sal : GTCGAC-Xho :CTCGAC 4、Pst :CTGCAG-Nsi : ATGCAT,Ligation animation,非定向克隆连接,酶切载体,被克隆基因,重组DNA分子,非定向克隆连接(匹配末端),非定向克隆连接(匹配末端),定向(连接)克隆,酶切载体,被克隆基因,重组DNA分子,定向(连接)克隆,酶切载体,被克隆基因,重组DNA分子,定向(连接)克隆,大肠杆菌宿主菌、感受态及连接物的转化,目前所有的基因克隆大肠杆菌宿主菌均是K12的衍生菌。常用的有DH5、HB101、JM109、JM105、TG1、XL1-blue、C60
32、0、BL21(DE3)等。 用低离子强度的CaCl 2(75-100mM)处理对数生长早期的宿主菌,可使宿主菌能够摄取外源DNA的能力，宿主菌的这种状态称为感受态。 转化是指细菌获得外源DNA的过程。以CaCl 2制备的感受态的转化率为105107个转化子/g超螺旋质粒DNA的能力，可满足常规的基因克隆工作。如果需要极高的转化率则可用电击转化法(electroporation),又称电穿孔法，其转化率可高达1091010个转化子/g超螺旋质粒DNA,转化子的鉴定,转化子是指获得外源DNA的宿主菌，连接物转化的E.coli中既有重组质粒的转化子，也有载体的转化子，转化子的鉴定即是将含重组质粒的转
33、化子所形成的菌落从中挑出来。有以下几种方法对其进行鉴定： 1、互补 2、小量制备质粒进行限制酶切鉴定 3、PCR 4、插入失活 5、杂交筛选 前三种方法是常用的方法，插入失活仅基因克隆的早期有所应用，如鉴定克隆在pBR322中所产生的重组子。杂交筛选用于大规模的重组子的筛选工作，如从cDNA文库中筛选目的基因。,互补,1、pUC、pGEM、pBluescript等系列克隆载体均可编码lacZ基因的N端146个aa，且该编码区中有一个MCS(不破坏lacZ的读框。 2、 DH5、JM109、JM105等宿主菌可编码lacZ基因的C端的aa 3、上述两种多肽各自没有酶活性，但它们结合在一起后却具有
34、酶学活性，这称为互补。 4、lacz能分解X-gal, 产生蓝色的分解产物。利用这一特性及互补可鉴定上述载体的重组质粒。,PCR鉴定重组质粒,小量制备质粒进行限制酶切鉴定,这是鉴定重组质粒的基本方法，通过互补鉴定和通过PCR鉴定的重组子有时需用此法进一步用此法鉴定。该方法既可鉴定所挑选的质粒是否为重组质粒，也能鉴定目的基因在重组质粒中的插入方向。该法是随机挑取单个的菌落小量培养，并提取质粒，然后用限制酶消化，通过凝胶琼脂糖电泳进行分析。,例：克隆于T-vector 中的PCV-2基因组之鉴定,PCV-2 RE sites,T-Vector Re sites,基因重组蛋白的表达,重组蛋白表达应考虑的一些因素,选择载体 读码框 基因表达：信号肽、跨膜区,