PARP-1和caspase-3在乳腺癌组织中的表达及临床意义.pdf

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1、 1 PARP-1 和 caspase-3 在乳腺癌组织中的表达及临床意义 硕士研究生：眭文妍 导 师：罗招阳 教授 中 文 摘 要 目的： 检测正常乳腺组织、乳腺良性病变和乳腺癌中 PARP-1 和 caspase-3 的表达 情况，研究它们与乳腺癌临床病理特征的关系，分析两者在正常乳腺组织、乳腺 良性病变和乳腺癌组织之间表达的相关性。 为寻找乳腺癌诊断标志物和判断乳腺 癌预后的指标提供依据。 方法： 1 收集资料完整的乳腺档案石蜡标本共 282 例，其中浸润性乳腺癌 267 例，乳 腺良性病变 15 例。收集新鲜的正常乳腺组织 11 例、乳腺良性病变组织 10 例、乳腺癌组织 10 例。根

2、据 WHO2003 年乳腺肿瘤组织学类标准对所有病 例进行诊断、分级。 2 应用免疫组织化学技术（SP 法）检测 11 例正常乳腺组织、25 例乳腺良性病 变、277 例乳腺癌中 PARP-1 和 caspase-3 的表达情况。 3 应用原位杂交技术检测正常乳腺组织、乳腺良性病变、乳腺癌各 10 例新鲜 标本中 PARP-1 mRNA 的表达情况。 4 采用 SPSS 16.0 软件进行统计学处理分析。 结果： 免疫组织化学显示：免疫组织化学显示： 1 PARP-1、caspase-3 蛋白的表达及其相关性 1.1 PARP-1 蛋白在乳腺癌、乳腺良性病变及正常乳腺组织中的表达 PARP-1

3、 在乳腺癌组中的阳性表达率（65.70%, 182/277） ，高于正常乳腺组 （27.27%, 3/11）和良性病变组（40.00%, 10/25） ，差异有统计学意义（p=0.009, p=0.011） ，而在正常乳腺组和良性病变组之间的表达差异无统计学意义（p 2 0.05） 。 1.2 caspase-3 蛋白在乳腺癌、乳腺良性病变及正常乳腺组织中的表达 Caspase-3 在正常乳腺组中的阳性表达率（81.82%, 9/11） ，高于乳腺癌组 （42.24%, 117/277）与乳腺良性病变组（11/25, 44.00%） ，差异有统计学意义 （p=0.009, p=0.035） 。

4、而 caspase-3 在乳腺良性病变组和乳腺癌组之间的表达比 较，差异无统计学意义（p0.05） 。 1.3 PARP-1 蛋白的表达与乳腺癌临床病理参数的关系 根据患者年龄、肿块大小和组织学分型进行分组，分析 PARP-1 在乳腺癌各 组中的表达，差异无统计学意义（p0.05） ；以组织学分级进行分组，组织学、 、级的 PARP-1 阳性表达率随着分级增加而呈上升的趋势，差异有统计学意 义（p0.001） ；以有无淋巴结转移进行分组，PARP-1 在有淋巴结转移组中阳性 表达率（76.47%, 130/170）明显高于无淋巴结转移组（48.60%, 52/107） ，结果有 统计学意义（p

5、0.001） 。 1.4 caspase-3 蛋白的表达与乳腺癌临床病理参数的关系 根据患者年龄、 组织学分型、 肿块大小、 组织学分级和淋巴结转移进行分组， 分析 caspase-3 在乳腺癌各组中的表达，差异均无统计学意义（p0.05） 。 1.5 PARP-1、caspase-3 蛋白在乳腺癌中表达的相关性 PARP-1 和 caspase-3 在乳腺癌组织中的表达， 相关分析结果显示两者的表达 呈负相关（r=-0.722, p0.001） 。 原位杂交结果显示：原位杂交结果显示： PARP-1 mRNA 在乳腺癌中的表达高于正常乳腺组和良性病变组，差异有统 计学意义（p=0.007,

6、p=0.025） 。 结论： 1 PARP-1 在乳腺癌中表达上调。 2 caspase-3 在乳腺癌中表达下调。 3 PARP-1 在乳腺癌中的表达与组织学分级、淋巴结转移关系密切并成正相关。 4 乳腺癌中 PARP-1 的表达与 caspase-3 的表达呈负相关性， 两者联合检测对乳 腺癌的诊断及预后评估具有一定价值。 关键词：PARP-1；caspase-3；乳腺癌；免疫组织化学；原位杂交 3 Expression and clinical significance of PARP-1, caspase-3 in breast cancer Abstract Objectives： T

7、his research was designed to investigate the expression and relationship of PARP-1 and caspase-3 protein in normal breast, benign lesional and breast cancer, and their correlation with clincopathologic features, for provide evidence for breast cancer of diagnosis and prognostic evaluation Methods： 1

8、 The 282 paraffin-embedded specimens were collected, including 267 cases of invasive breast cancer and 15 cases of benign lesions. 11 cases of fresh normal breast, 10 cases of fresh benign lesions and 10 cases of fresh invasive breast cancer were collected. Diagnosis of all cases, sub-type classific

9、ation, according to the WHO(2003) breast tumor histologic classification. 2 The expression of PARP-1 and caspase-3 was measured by immunohistochemistry SP methods in 11 cases of normal breast, 25 cases of benign lesions and 277 cases of invasive breast cancer. Analyze the relationship between the ex

10、pression of PARP-1 and caspase-3 and the pathological characteristics. 3 In situ hybridization method was used to examine for the expression, relation and the effect of PARP-1 mRNA in 10 cases of fresh normal breast, 10 cases of fresh benign lesions and 10 cases of fresh invasive breast cancer. Resu

11、lts: Immunohistochemistry results showed that 1 The expression and relevance of the PARP-1 and caspase-3 protein 1.1 The expression of the PARP-1 protein in breast cancer, benign breast lesions and normal breast 4 The positive rate of the expression of PARP-1 in breast cancer (65.70%, 182/277) is hi

12、gher than that in normal breast (27.27%, 3/11) and benign lesions(44.00%, 10/25), the difference has statistical significance(p=0.009, p=0.011). There is no statistical significance on positive rate of the expression of PARP-1 between normal breast and benign lesions(p0.05). 1.2 The expression of th

13、e caspase-3 protein in breast cancer, benign breast lesions and normal breast The positive rate of the expression of caspase-3 in normal breast(81.82%, 9/11) is higher than that in breast cancer(42.24%, 117/277) and that in benign lesion, the difference has statistical significance(p=0.009, p=0.035)

14、There was no statistical significance on positive rate of the expression of caspase-3 between benign lesions and breast cancer (p0.05). 1.3 The relation between the parameters of clinicopathological and the expression of the PARP-1 protein There is no statistical significance between The positive ra

15、te of the expression of PARP-1 and age, tumour size, histological classification(p0.05). The positive rate of the expression of PARP-1 in histological grade , , period were upward trend, the difference between group is significance(p0.001). The positive rate of the expression of PARP-1 in the lymph

16、node matastasis group(76.47%, 130/170) is higher than that in the no lymph node matastasis group(48.60%, 52/107), the difference has statistical significance(p0.001). 1.4 The relation between the parameters of clinicopathological and the expression of the caspase-3 protein There is no statistical si

17、gnificance between The positive rate of the expression of caspase-3 and age, tumour size, histological classification, histological grade (p 0.05). 1.5 The correlativity of PARP-1 and caspase-3 protein expression in breast cancer The positive rate of the expression of PARP-1 is negative correlation

18、with caspase-3, correlation analysis showed that PARP-1 and caspase-3 in breast cancer 5 tissues are direct correlation(r=-0.722, p0.001). In situ hybridization results showed that PARP-1 mRNA expression in breast cancer is higher than the normal group and benign breast lesions, the difference has s

19、tatistically significance(p=0.007, p=0.025). Conclusions: 1 The expression of PARP-1 in breast cancer is higher than that in normal breast and in benign lesions. 2 The expression of caspase-3 in breast cancer is lower than that in normal breast and in benign lesions. 3 There is statistical significa

20、nce between the positive rate of the expression of PARP-1 and histological grade, lymph node matastasis. 4 The positive rate of the expression of PARP-1 is negative correlation with caspase-3 of in breast cancer. Increased expression of PARP-1 may be related to the malignant biological behavior of b

21、reast cancer. PARP-1 and caspase-3 were conduced to the judgement and prognosis of breast cancer. Key words: Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1; caspase-3; breast cancer; immunohistochemistry; In situ hybridization Postgraduate： Sui Wenyan(Pathology and Pathophysiology) Directed by Prof. Luo Zhaoyang 6

22、前 言 乳腺癌是严重危害女性健康最常见的恶性肿瘤之一。 近年来我国乳腺癌的发 病率及检出率有明显增高的趋势，在部分城市已上升为女性恶性肿瘤的第一位， 死亡率仅次于肺癌。乳腺癌的发生与发展是一个多因素、多步骤、多阶段共同参 与的复杂病理过程，具体的发病机制目前尚不清楚。近年来的研究认为，乳腺癌 是一种全身性疾病，即使是在原发灶很小时，就可能有远处转移，其死亡原因几 乎都是远处转移所致。因此，进一步了解与乳腺癌转移有关的基因和基因产物对 乳腺癌转移的研究意义重大，已成为当前研究的热点。 聚 ADP 核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）是一类存在于多 数真核细

23、胞中的蛋白质翻译后修饰酶，主要存在于细胞核内，少量存在于细胞浆 内1。目前研究发现，PARP 家族至少有 18 个成员，分别是：PARP-1，PARP-2， PARP-3，PARP-4VPARP，Tankyrase-1 和-2 等。 PARP-1 Poly (ADP-ribose) polymerase-1，PARP-1系 PARP 家族重要成员之 一2， 分子质量为 113-116kDa， 是一种对 DNA 断端特别敏感的核蛋白酶， PARP-1 与DNA断端结合后即被激活， 其酶活性约占细胞内PARP总活性的90%。 PARP-1 的肽链中包含 3 个主要功能性结构域，N 端 DNA 结合

24、域（DNA-binding domain, DBD） 、 自我修饰结构域 （automodification domain, AMD） 和 C 末端催化域。 DBD 位于 N-末端第 1-372 氨基酸残基之间，它包含两个碱性部分：一个核定位序列 （nuclear localization sequence, NLS）和两个锌指结构（Zn figure） ，这两个锌指 结构参与识别 DNA 缺口，第 1 个锌指识别 DNA 单链和双链断裂的缺口，它的 突变会大大降低 PARP-1 的激活； 第 2 个锌指只参与 DNA 单链断裂缺口的识别。 PARP-1 能够利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+

25、） ，把 ADP-核糖转移到受体蛋 白（包括多种转录因子以及 PARP-1 自身等）的谷氨酸残基上，参与聚 ADP 糖 基化过程，从而改变了受体蛋白的生物学活性，影响其生物学效应的发挥。 PARP-1 在受损 DNA 链断裂后的修复及其续发反应中所起作用越来越受到重视。 当细胞核 DNA 损伤及缺口产生时，导致 PARP-1 激活，活化的 PARP-1 识别并 结合 DNA 缺口，形成同型二聚体，催化 NAD+降解为烟酸和 ADP-核糖，通过对 受体蛋白的聚 ADP 核糖基化的修饰作用及自身修饰和聚 ADP 核糖水解酶 poly(ADP-ribose) glycohydrolase, PARG

26、的作用， 传递细胞受损程度启动 DNA 修 7 复系统，能有效地修复 DNA 损伤3-5。PARP-1 对核内众多的蛋白质和酶类进行 翻译后修饰，在 DNA 损伤修复、DNA 复制、细胞增殖分化调控、细胞凋亡及肿 瘤发生中发挥着重要作用6,7。因此，PARP-1 可能与多种疾病的发生发展有关。 有研究表明，大量激活的 PARP-1 则会触发细胞凋亡信号，诱导线粒体释放凋亡 诱导因子（apoptosis inducing factor, AIF） ，使 DNA 断裂导致细胞凋亡8-10。 关于 PARP-1 与肿瘤发生的关系日益受到关注，有文献报道，在多种恶性肿 瘤（如小儿中枢神经系统肿瘤、结直

27、肠肿瘤、白血病、前列腺癌、皮肤恶性黑色 素瘤等）PARP-1 表达均比正常对照组织明显增强11-15；在增生性子宫内膜、不 典型增生性子宫内膜和 I 级子宫内膜癌，PARP-1 蛋白表达逐渐增强16。在肝癌 组织中， PARP-1表达增强与细胞增殖相关原癌基因c-fos及细胞增殖核抗原Ki-67 的表达相关。在肿瘤发生过程中，PARP-1 的活性与细胞分化程度有关，肿瘤细 胞自身可以对抗 PARP-1 的抑制或失活，从而最大限度地避免细胞坏死17，因此 PARP-1 可能参与肿瘤的发生发展，而 PARP-1 在乳腺癌中的表达，其与肿瘤的 侵袭转移是否有关，其是否参与肿瘤的侵袭转移，尚不十分清楚

28、。 细胞凋亡过程受抑制与恶性肿瘤的发生发展密切相关。Caspase 家族成员的 激活是细胞凋亡效应期的一个十分重要的生化事件。 Caspase-3 是 caspase 家族中 最重要的成员，大多数触发细胞凋亡的因素最终均需通过 caspase-3 介导的信号 传导途径导致细胞凋亡，caspase-3 是细胞凋亡过程中的关键效应分子，据报道 caspase-3 是通过降解其酶底物如 PARP-1、DNA 裂解因子（DNA fragmentation factor, DFF45）和 Lamin B 等而促进细胞凋亡18。当 DNA 损伤严重时，PARP-1 的大量激活将引起细胞能量耗竭，为防止 N

29、AD+和三磷酸腺苷（ATP）大量消耗， 激 活 caspase-3 识别 PARP-1 中 核定位信号 NLS 中 caspase 切割位点 Asp-Glu-Val-Asp （DEVD） 序列， 从而剪切 PARP-1， 将 PARP-1 切割为两个片段： p89 和 p24。使 PARP-1 的 DNA 结合域与催化域分开，酶活性失活。p89 和 p24 切割片段通过抑制完整 PARP-1 的单体多聚化和与 DNA 的结合而抑制其活性最 后使核小体间 DNA 降解导致细胞凋亡19。 这种 caspase 介导的 PARP-1 抑制的正 反馈提示 PARP-1 活性在凋亡机制中起着重要作用。

30、本研究拟检测 PARP-1 和 caspase-3 蛋白在乳腺癌、乳腺良性病变和正常乳 腺组织中的表达情况，初步探讨 PARP-1 和 caspase-3 蛋白与乳腺癌各临床病理 8 参数之间的相关性，并探讨两者在乳腺癌发生、发展过程中的作用；同时，应用 原位杂交法检测 PARP-1 mRNA 在乳腺癌、 乳腺良性病变及正常乳腺组织中的表 达，在基因水平上进一步探讨 PARP-1 在乳腺癌中的表达，为寻找乳腺癌新的诊 断标志物和评估预后提供理论及实验依据。 9 材料与方法 1、实验材料 1.1 样本与临床病理资料 收集南华大学病理教研室 2008 年 1 月-2008 年 4 月， 南华大学附

31、属第二医院 2006 年 12 月-2008 年 5 月，南华大学南华附属医院 2006 年 7 月-2009 年 4 月档 案石蜡切片标本共 282 例，以及以及南华大学附属第一医院新鲜手术切除标本 31 例。术前均未经放疗、化疗。所有样本包括乳腺癌 277 例，乳腺良性病变（包 括乳腺纤维腺瘤和乳腺腺病）25 例，乳腺正常组织（乳腺癌根治术标本的乳腺 正常上皮组织）11 例。乳腺癌患者的年龄为 17-78 岁，中位年龄 48 岁，有淋巴 结转移的乳腺癌 170 例， 无淋巴结转移的乳腺癌 107 例。 肿瘤体积2.5cm 的 179 例，2.5cm 的 98 例。乳腺癌中，导管癌 240

32、例，非导管癌 37 例，其中组织学 级 68 例、级 147 例、级 62 例；非导管癌中包括髓样细胞癌 11 例，乳腺 浸润性小叶癌 14 例，乳腺乳头状癌 2 例，混合癌 1 例，恶性纤维组织细胞瘤 1 例，富脂质细胞癌 2 例，黏液癌 6 例。 1.2 主要实验仪器 1.高压锅：中国 2.电烤炉：中国 3.切片机 ：LEICA 公司生产，型号为 RM2135 4.光学显微镜 ：日本 Olympus 公司 5.照相显微镜：日本 Olympus 公司 6.电子分析天平：美国 Sartorius 公司 7.低温高速离心机：德国 Eppendorf 公司 8.微量移液器（10 l、20 l、10

33、0 l、1000 l） ：德国 Eppendorf 公司 9.-80超低温冰箱：日本 Sanyo 公司 10.半自动组织包埋机：英国 SHANDON 公司 11.全自动真空脱水机：英国 SHANDON 公司 1.3 主要试剂和耗材 1.鼠抗人 PARP-1 抗体 北京康为世纪生物科技有限公司 浓缩液 1：50 2.鼠抗人 caspase-3 抗体 美国 ABZOOM 公司 浓缩液 1：200 10 3.PARP-1 原位杂交检测试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 4.三步法 SP 通用试剂盒 福州迈新生物技术公司 5.DAB 显色剂 福州迈新生物技术公司 6.原位杂交专用载玻片 武汉博士德生物

34、工程有限公司 7.原位杂交专用 PBS 武汉博士德生物工程有限公司 2、方法 2.1 石蜡切片和 HE 染色 2.1.1 主要溶液配制 1) 苏木精染液（20 ） ：苏木精 0.5 克、铵矾 24 克、NaIO30.5 克、蒸馏水 50ml、 甘油 30 克、冰醋酸 2ml。 2) 2）1%的伊红染液：将 1 克伊红溶于 100ml 蒸馏水中。 2.1.2 石蜡切片的制备 1) 乳腺癌、乳腺良性病变、正常乳腺组织标本手术切除后，取 1 1 0.2cm 大小 的组织放置于装有 10%福尔马林溶液的容器中，常规石蜡包埋。 2) 对每个石蜡块进行连续切片， 厚 4m， 粘贴于多聚赖氨酸处理过的载玻片

35、上， 70烘烤 2 小时，4冰箱保存备用，做 HE 染色和免疫组织化学染色。 2.1.3 石蜡切片 HE 染色 1) 切片从冰箱拿出后，70烘烤 30 分钟，室温下冷却后，用二甲苯脱蜡 2 次， 每次 10 分钟。 2) 100%、95%、80%梯度酒精水化各 5 分钟，用蒸馏水冲洗 1 分钟。 3) 苏木精染液染色 5 分钟，自来水稍冲洗。 4) 1%盐酸乙醇分化 4 秒，自来水冲洗返蓝约 15 分钟。 5) 伊红染液染色 2 分钟； 6) 用 80%、95%、100%梯度酒精脱水干燥各 5 分钟，二甲苯透明 2 次，每次 5 分钟，中性树胶封片。 2.1.4 病理形态观察 按 2003 年

36、 WHO 肿瘤病理学及遗传学分类 ， 采取 Elston 和 Ellis 半定量法 对浸润性导管癌和其他类型浸润癌均通过对腺管/腺体形成、核多形性核核分裂 计数的评估进行分级。分级方法：腺管形成：肿瘤的多数（75%）形成腺管 11 和腺体为 1 分；中等程度形成腺管和腺体（10%-75%）为 2 分；少或无（10%） 腺管形成为 3 分。核多形性：细胞小，形态规则一致为 1 分，细胞形态有适度 的变化为 2 分，细胞形态变化显著为 3 分。核分裂计数：计算 10 个高倍视野 总的核分裂数，从肿瘤外周的主要区域选择计数核分裂的视野，如果存在多种多 样变化，则选择核分裂频率高的区域。在 400 的

37、镜下，核分裂计数：0-5 为 1 分， 6-10 为 2 分，11 为 3 分。分级：将 3 组数值加在一起可得到 3-9 的积分结 果，其相应的组织学级别分配如下，3-5 分为级，6-7 分为级，8-9 分为级。 2.2 免疫组织化学染色 2.2.1 主要溶液配制 1) 0.1M PBS：称取 1.48 克 NaH2P04.2H2O 与 14.51 克 Na2HP04.12H2O 溶解于 800ml 双蒸水中，调 PH 至 7.4，定容至 1000ml。 2) 枸橼酸盐抗原修复液：0.01 M，PH6.0 左右，贮存液 A：0.1M 柠檬酸钠 （Na3C6H5O7.2H2O2）29.41g

38、溶于 1000ml 蒸馏水；B：0.1M 柠檬酸 （C6H8O7.H2O2）21.0g 溶于 1000ml 蒸馏水；工作液： 9.5ml 的 A 液、40.5ml 的 B 液，蒸馏水补充至 500ml。 3) DAB 显色剂：1ml 蒸馏水中滴加 A、B、C 瓶液体各一滴（约 50l） ，混匀； 即用即配。 4) 多聚赖氨酸溶液：多聚赖氨酸与蒸馏水 1：10 配置。 2.2.2 载玻片和盖玻片的处理 1) 将盖玻片和载玻片泡酸 24 小时， 自来水浸泡冲洗， 蒸馏水浸泡 3 分钟， 70 烤箱烤片 30 分钟至 1 小时。 2) 将洗净烘干的载玻片放入多聚赖氨酸溶液中 35浸泡 5 分钟，70

39、烤箱烘 干，放入冰箱备用。 2.2.3 免疫组织化学染色 每次染色均设空白对照（以 PBS 液代替一抗） 1) 石蜡切片在 70烤箱烘烤 30 分钟至 1 小时。 2) 新鲜二甲苯脱蜡 2 次，每次 15 分钟。 3) 100%、95%、80%梯度酒精水化各 3 分钟；蒸馏水冲洗 1 次，3 分钟，PBS （PH7.4）冲洗 3 次，每次 3 分钟。 12 4) 枸橼盐酸抗原修复液对组织抗原进行相应的修复，冷却至室温后，PBS 冲洗 3 次，每次 3 分钟。 5) 除去 PBS，每张切片加 50l 过氧化物酶阻断溶液（试剂 A） ，室温下孵育 10 分钟，以消除内源性过氧化酶的活性。PBS 冲

40、洗 3 次，每次 3 分钟。 6) 除去 PBS 液，每张切片加 50l 正常非免疫动物血清（试剂 B） ，室温下孵育 10 分钟。 7) 倾去血清，每张切片加 50l（以覆盖所有组织为准）适当比例稀释的一抗， 4过夜或室温下孵育 1.5 小时。PBS 冲洗 3 次，每次 3 分钟。 8) 除去 PBS 液，每张切片加 50l 生物素标记的第二抗体（试剂 C） ，室温下孵 育 10 分钟。PBS 冲洗 3 次，每次 3 分钟。 9) 除去 PBS 液，每张切片加 50l 链霉素抗生物素-过氧化酶溶液（试剂 D） ， 室温下孵育 10 分钟。PBS 冲洗 3 次，每次 3 分钟。 10) 除去

41、PBS 液，每张切片加 100l 新鲜配制的 DAB 溶液，显微镜下观察染色 情况，控制显色时间，约 3 分钟-5 分钟。 11) 自来水冲洗，终止显色，苏木素复染，自来水冲洗返蓝约 5 分钟。 12) 切片用 80%、95%、100%梯度酒精脱水干燥各 2 分钟，二甲苯透明 2 分钟， 中性树胶封片，显微镜下观察结果。 2.2.4 PARP-1 和 caspase-3 的结果判定计数与评分 PARP-1 和 caspase-3 抗原阳性物为棕黄色颗粒，PARP-1 表达主要定位于胞 核或/和胞质；caspase-3 的表达主要定位于胞质，亦可见于胞核和核膜。通过计 数在胞核上或/和胞质内有阳

42、性染色的细胞个数进行组织学分析 PARP-1 和 caspase-3 的表达。光镜下每张切片中选取癌细胞较多的 5 个高倍视野（400 ） ， 每个视野计数 100 个细胞。染色强度分级如下：无着色为 0 分，淡黄色为 1 分， 棕黄色为 2 分，棕褐色为 3 分；阳性细胞百分比分级为：无阳性细胞为 0 分，阳 性细胞数10%为 1 分，11%-50%为 2 分，51%-75%为 3 分，75%为 4 分。结 果判断：两项得分相乘结果3 分为阳性表达病例，3 分为阴性表达病例，其 中 0-2 分为（） ，3-4 分为（+） ，6-8 分为（+） ，9-12 分为（+） 。 2.3 原位杂交技术

43、 2.3.1 主要溶液配制 13 2.3.1 主要溶液配制 1) 器皿处理的处理和溶液的配制原则：杂交操作前使用的所有溶液均用 DEPC 水配制并经高压消毒，实验器皿 70烘烤 4 小时。实验操作过程戴手套，杂 交所需溶液用灭菌蒸馏水配制。 2) 3%柠檬酸：100ml 蒸馏水中加柠檬酸（C6H8O72H2O）3 克，PH2.0 左右。 3) 2 SSC：1000ml 蒸馏水中加 NaCl 17.6 克，柠檬酸三钠（C6H5O7Na32H20， 分子量 294）8.8 克。 4) 0.5 SSC：300ml 蒸馏水加 100ml 2 SSC 即可。 5) 0.2 SSC：270ml 蒸馏水加

44、30ml 2 SSC 即可。 6) 20%甘油：20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可。 7) 原位杂交用 PBS： 0.02M phoshapate； 0.5M NaCl （1000ml 蒸馏水中加 NaCl 30 克，Na2HPO412H2O 6 克，NaH2PO42H2O 0.4 克） ，PH 7.2-7.6。 8) 组织固定液 4%的多聚甲醛：A 液：多聚甲醛 40g、蒸馏水 400ml；B 液： NaH2PO42H2O 16.88g、蒸馏水 300ml；C 液：NaOH 3.86g、蒸馏水 200ml。 配置：使用前，先将 B 液与 C 液混合，再加入 A 液，并以适量的 NaOH

45、或 HCl 调节 PH 值为 7.2-7.4，补充水至 1000ml，4冰箱保存备用。 2.3.2 人 PARP-1 靶基因的 mRNA 序列为： （1）5 ，ACTCG CTCCG GATGG CCATC ATGGT GCAGT3， ； （2）5 ，GACTT TGCAG CAGAG TATGC CAAGT CCAAG3， ； （3）5 ，TCACT GCCTG GACCA AGTGT ATGGT CAAGA3， 。 2.3.3 石蜡切片的制备 标本离体后，取一块 1 1 0.2cm3大小的组织，用 4%的多聚甲醛固定，含有 1/1000DEPC，固定 1 小时。按常规进行脱水包埋成石蜡块，

46、按常规方法制成组 织切片。切片厚 6-8m，制备过程中戴手套，70%酒精檫洗工作面、切片机的刀 架、摇柄和载物台等手常接触的部位。展片时用 0.04%DEPC 处理过的超纯水。 切片放在 60干烤 6 小时-8 小时，便于和载玻片贴得更紧密，进行下一步实验。 2.3.4 原位杂交染色 1) 石蜡切片经常规脱蜡至水。蒸馏水洗 5 分钟 3 次。 2) 30%H2O2 1 份+蒸馏水 10 份混合，室温 10 分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗 5 14 分钟 3 次。 3) 暴露 mRNA 片段：切片上 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3%柠檬酸加 2 滴浓缩型胃蛋白酶，混匀） ，37消 25

47、分钟。原位杂交用 PBS 洗 5 分钟 3 次，蒸馏水洗 1 次。 4) 预杂交：湿盒的准备：干的杂交盒底部加 20%甘油 20ml 以保持湿度。按每 张切片 20l 加预杂交液。恒温箱 38-42 3 小时。吸取多余液体，不洗。 5) 杂交：按每张切片 20l 杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保 护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱 38-42杂交过夜。 6) 杂交后洗涤：揭开盖玻片，37左右水温的 2 SSC 洗涤 5 分钟 2 次；37 左右水温的 0.5 SSC 洗涤 15 分钟 1 次；37左右水温的 0.2 SSC 洗涤 15 分钟 2 次。 7) 滴加封闭液：37 30 分钟

48、。甩去多余液体，不洗。 8) 滴加生物素化鼠抗地高辛：37 60 分钟。原位杂交用 PBS 洗 5 分钟 4 次。 9) 滴加 SABC：37 20 分钟。原位杂交用 PBS 洗 5 分钟 3 次。 10) 滴加生物素化过氧化物酶：37 20 分钟。原位杂交用 PBS 洗 5 分钟 4 次。 11) DAB 显色：每张切片加 50l 新鲜配制的 DAB 溶液，光镜下控制显色时间， 约 3 分钟-5 分钟。 12) 自来水冲洗，终止显色，苏木素复染，自来水冲洗返蓝。 13) 切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察结 果。 2.3.5 结果判定 PARP-1 mRNA 的

49、抗原阳性物为棕黄色颗粒，定位于细胞胞浆和（或）胞膜 上。 通过计数胞浆内和 （或） 胞膜上有阳性染色的细胞个数进行组织学分析 PARP- 1 mRNA 的表达。光镜下每张切片中选取癌细胞较多的 5 个高倍视野（400 ） ， 每个视野计数 100 个细胞。染色强度分级如下：无着色为 0 分，淡黄色为 1 分， 棕黄色为 2 分，棕褐色为 3 分；阳性细胞百分比分级为：无阳性细胞为 0 分，阳 性细胞数10%为 1 分，11%-50%为 2 分，51%-75%为 3 分，75%为 4 分。结 果判断：两项得分相乘结果3 分为阳性表达病例，3 分为阴性表达病例，其 中 0 分-2 分为阴性（） ，3 分-4 分为弱阳性（+） ，6 分-8 分为中度阳性（+） ， 15 9 分-12 分为强阳性（+） 。 3、统计学分析 采用 SPSS16.0 统计学软件处理分析，两个率的