β-谷甾醇对Hela和耐药Hela DDP细胞中miRNAs及靶基因的影响.pdf

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1、哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 IV 目目 录录 摘 要 . I Abstract II 第 1 章 绪论 1 1.1 立题背景 1 1.2 -谷甾醇 . 2 1.3 MicroRNAs 研究进展 3 1.3.1 MicroRNAs 的发现及形成 3 1.3.2 MicroRNAs 与癌症发生 4 1.4 MicroRNAs 的检测方法 6 1.4.1 Northern blot 印迹 6 1.4.2 实时荧光定量 PCR 检测技术 7 1.4.3 MicroRNAs 微阵列技术 7 第 2 章 材料与方法 8 2.1 实验材料及仪器 . 8 2.1.1 材料与试剂 . 8 2.1.2 实验仪

2、器 . 9 2.2 实验方法 . 9 2.2.1 实验技术路线 9 2.2.2 细胞培养与传代 . 9 2.2.3 药物配制 . 10 2.2.4 药物对 Hela 细胞与 Hela/DDP 细胞的生长抑制作用 . 11 2.2.5 Hela 细胞芯片扫描及分析 11 2.2.6 Hela 和 Hela/DDP 中 microRNAs 荧光定量 PCR . 14 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 V 2.2.7 Hela 和 Hela/DDP 中 microRNAs 靶基因的荧光定量 PCR . 17 第 3 章 -谷甾醇和顺铂对 Hela 和 Hela/DDP 的抑制作用分析. 22 3.1

3、药物处理后 Hela 及 Hela/DDP 细胞镜检结果 22 3.2 抑制率测定 . 24 3.2.1 不同浓度的 -谷甾醇对 Hela 及 Hela/DDP 细胞的抑制作用 24 3.2.2 不同浓度的顺铂对 Hela 及 Hela/DDP 细胞的抑制作用 . 24 3.3 本章小结 . 24 第 4 章 Hela 细胞药物处理前后 TagMan MicroRNA 芯片扫描分析结果 . 26 4.1 RNA 纯度检测及浓度计算 . 26 4.2 电泳检测结果 . 26 4.3 芯片结果分析 . 27 4.3.1 -谷甾醇作用 Hela 细胞后 microRNAs 的差异表达情况 27 4.

4、3.2 顺铂处理后表达情况分析 . 28 4.3.3 两种药物比对及目标 microRNAs 的选择 29 4.3.4 靶标预测及筛选 . 29 4.3.5 靶标功能富集分析 . 30 4.3.6 通过靶标反向查找 microRNAs . 31 4.3.7 靶标与对应 microRNAs 之间的能量学分析 32 4.4 本章小结 . 35 第 5 章 Hela 细胞荧光定量 PCR 结果 . 36 5.1 RNA 样品的浓度测定及检测 . 36 5.1.1 RNA 样品吸光值测定结果 . 36 5.1.2 电泳检测结果 . 37 5.2 MicroRNAs 荧光定量 PCR 结果 37 5.2

5、.1 内参 U6 的荧光定量 PCR 检测结果 . 37 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 VI 5.2.2 Hsa-miR-21 荧光定量 PCR 检测结果 38 5.2.3 Hsa-miR-143 荧光定量 PCR 检测结果 39 5.2.4 Hsa-miR-504 荧光定量 PCR 检测结果 41 5.2.5 Hsa-miR-10b 荧光定量 PCR 检测结果 42 5.3 本章小结 43 第 6 章 Hela 细胞中靶基因的荧光定量 PCR 结果分析 45 6.1 PCR 检测引物扩增片段结果分析 45 6.1.1 内参基因 ACTB 电泳检测结果. 45 6.1.2 靶标基因 PDCD

6、4 电泳检测结果. 45 6.1.3 靶标基因 TP53 电泳检测结果. 46 6.1.4 靶标基因 RAC3 电泳检测结果 . 46 6.1.5 靶标基因 JNK1 电泳检测结果 47 6.2 靶基因荧光定量 PCR 结果 47 6.2.1 内参基因 ACTB 的荧光定量 PCR 结果 47 6.2.2 靶基因 PDCD4 的荧光定量 PCR 结果 . 48 6.2.3 靶基因 TP53 的荧光定量 PCR 结果 . 50 6.2.4 靶基因 RAC3 的荧光定量 PCR 结果 52 6.2.5 靶基因 JNK1 的荧光定量 PCR 结果 54 6.3 本章小结 . 55 第 7 章 Hel

7、a/DDP 细胞 microRNAs 荧光定量 PCR 结果 57 7.1 RNA 样品的浓度测定及检测 . 57 7.1.1 RNA 样品吸光值测定结果 . 57 7.1.2 电泳检测结果 . 58 7.2 MiroRNAs 荧光定量 PCR 结果 58 7.2.1 内参 U6 的荧光定量 PCR 检测结果 . 58 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 VII 7.2.2 Hsa-miR-21 荧光定量 PCR 检测结果 59 7.2.3 Hsa-miR-143 荧光定量 PCR 检测结果 60 7.2.4 Hsa-miR-504 荧光定量 PCR 检测结果 62 7.2.5 Hsa-miR-1

8、0b 荧光定量 PCR 检测结果 62 7.3 本章小结 . 63 第 8 章 Hela/DDP 细胞中 microRNAs 靶基因的荧光定量 PCR 结果分析 64 8.1 PCR 检测引物扩增片段结果分析 64 8.1.1 内参基因 ACTB 电泳检测结果. 64 8.1.2 靶标基因 PDCD4 电泳检测结果. 64 8.1.3 靶标基因 TP53 电泳检测结果. 65 8.1.4 靶标基因 RAC3 电泳检测结果 . 65 8.1.5 靶标基因 JNK1 电泳检测结果 66 8.2 靶基因的荧光定量 PCR 结果 66 8.2.1 内参基因 ACTB 的荧光定量 PCR 结果 . 66

9、 8.2.2 靶基因 PDCD4 的荧光定量 PCR 结果 . 67 8.2.3 靶基因 TP53 的荧光定量 PCR 结果 . 69 8.2.4 靶基因 RAC3 的荧光定量 PCR 结果 71 8.2.5 靶基因 JNK1 的荧光定量 PCR 结果 72 8.3 本章小结 . 74 第 9 章 Hela 细胞与 Hela/DDP 细胞的荧光定量 PCR 结果比较及分析 75 9.1 Hela 细胞与 Hela/DDP 细胞结果比较 . 75 9.1.1 两种细胞 microRNAs 变化比较 75 9.1.2 两种细胞靶基因变化比较 . 76 9.2 MicroRNAs 与靶基因间的调控

10、77 9.2.1 Hsa-miR-21 与靶基因 PDCD4 77 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 VIII 9.2.2 Hsa-miR-504 与靶基因 TP53 78 9.2.3 Hsa-miR-143 与 TP53 和 RAC3 79 9.2.4 Hsa-miR-504 与 RAC3 和 JNK1 . 79 9.2.5 Hsa-miR-10b 与其靶基因 TIAM1 81 9.3 本章小结 . 81 结 论 82 参考文献： 83 附录一: 成簇分布 miRNAs 的靶标基因 . 91 附录二: 靶标基因对应的 microRNAs . 95 附录三：Hela 细胞 microRNA 荧光

11、定量 PCR 扩增曲线 98 附录四：Hela 细胞靶基因荧光定量 PCR 扩增曲线 108 附录五：Hela/DDP 细胞 microRNAs 的荧光定量 PCR 扩增曲线 118 附录六：Hela/DDP 细胞靶基因荧光定量 PCR 扩增曲线 . 126 攻读硕士期间发表的学术论文 136 哈尔滨工业大学硕士学位论文原创性声明 137 哈尔滨工业大学硕士学位论文使用授权书 137 致 谢 138 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 1 第 1 章 绪论 1.1 立题背景 目前，宫颈癌是全球女性疾病中普遍存在的，发病率最高的癌症之一，每年 全球新增的病例就高达 470000 左右，并且每年因患宫

12、颈癌而导致死亡的人大约有 233000 例1。由此可见它对全球女性的健康危害之大，尤其是在不发达的国家和 发展中国家发病高达全球总发病率的 80%之多2。并且根据近年来统计显示，宫颈 癌的发病率只增不减，更严重的是它已经逐步地开始伸向年轻女性的群体中，并 且此类疾病在早期不易被人们发现，一经查出多为癌症晚期，不利于治疗和预防。 宫颈癌的发生与高危性 HPV 病毒的感染之间存在着相关性，这已经被明确地证实 了。高危性 HPV 病毒，如 HPV16,HPV18,HPV31 在宫颈鳞状细胞癌中已经检测出 高达 99.7%，在宫颈腺鳞状细胞癌中高达 94%-100%3-4。E6、E7 是高危性 HPV

13、 癌 基因的蛋白， 它们的主要作用是使细胞内的一些肿瘤抑制因子蛋白， 如 p53 和 pRb 等受到抑制或使其钝化，从而提高了发病率，抑制了细胞的凋亡5。 当前，在临床治疗上普遍使用的化疗药物如顺铂（cis-platin ，DDP） ，多是 药性极强的药物， 它们的作用机理多是采取非特异性破坏肿瘤细胞的 DNA 来达到 抑癌的目的，由于是非特异性的，在治疗过程中也会对人体正常的组织细胞具有 毒害作用，并且随着用药量的增加，毒害性越大越明显。另外这种传统药物还会 产生的弊端就是，经过长期治疗之后，患者很容易产生耐药性，对后期的治疗极 其不利。因此寻找低毒高效的抑癌药物对于宫颈癌的治疗是迫不及待的

14、。 -谷甾醇为天然药用植物的提取产物，目前已被应用到癌症的临床治疗中。 曾有研究报道 -谷甾醇在治疗宫颈癌中发挥着客观的作用效果6，这就说明了 - 谷甾醇对子宫癌的治疗具有较显著的功效，这使得进一步对其药理药性的研究具 有了深远性的意义。天然产物对人体的正常细胞的毒副作用要远小于顺铂这类传 统药物，这就大大增强了药物对癌细胞的专一作用性。其次，-谷甾醇为天然药用 植物的提取产物，易获得，所以对它的研究会也大大降低治疗癌症的成本。 目前人们对 -谷甾醇的抗癌机理知之甚少，只有少部分文章对其机理进行推 测，现有研究认为 -谷甾醇破坏了癌细胞内部的细胞骨架结构微管，使得细胞 的有丝分裂受到抑制，从而

15、使癌细胞停止分裂。本研究主要利用分子生物学手段， 对 -谷甾醇处理过的 Hela 细胞和耐顺铂 Hela 细胞进行分子水平检测，分析 -谷 甾醇处理前后，Hela 细胞和耐顺铂 Hela 细胞中 miRNAs 表达水平的差异，试从 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 2 microRNAs 层面上探讨 -谷甾醇的作用机理，为今后 -谷甾醇的合理临床使用和 寻找更有效的癌症分子治疗手段打下坚实的基础。 目前已有很多报道证实一些 microRNAs 与癌症发生存在着相关性， 它们可以 作为一种潜在的有效的工具在肿瘤细胞中发挥着作用。不同 microRNAs 在宫颈癌 细胞中，出现差异性的表达，从而调节

16、细胞的一些生理行为，如细胞周期，细胞 增殖与凋亡等。 1.2 -谷甾醇 -谷甾醇已经成为甾醇类药物中一种及其重要的物质。 -谷甾醇是天然产生的 植物固醇类，是四环三帖类化合物，普遍存在于许多植物和中草药中，它的主要 分子骨架是环戊烷全氢菲，在结构上与胆固醇结构极其相似（如图 1-1） 。 图1-1 -谷甾醇的化学结构 -谷甾醇在室温下多呈现为白色粉末或针状结晶状态，熔点很高，大约为 130-140之间，不溶于水多溶于一些有机溶剂中，如乙醇、乙酸乙酯和二甲基亚 砜等7，它具有很多生物活性，由于 -谷甾醇与胆固醇结构相似，它可以抑制人体 对胆固醇的吸收，进而降低了人体内的胆固醇含量，与此同时它还能

17、抑制胆固醇 的生物合成， 从多方面预防了高胆固醇疾病的发生。 -谷甾醇还具有抗氧化、 抗癌、 抗炎、免疫活性等8-15作用，作为一种新型的抗肿瘤药物，已经备受人们的关注。 如今-谷甾醇在肿瘤中的治疗和防治作用已经成为当前研究热点， 已有研究发 现-谷甾醇可阻断致癌物的致癌作用，对癌症发生有抑制和预防作用。对结肠癌、 乳腺癌、前列腺癌、白血病等都具有明显的防治作用。研究发现-谷甾醇以明显的 剂量相关性抑制了COLO 320 DM细胞的生长，并通过清除活性氧自由基诱导了细 胞凋亡，同时也抑制了-连环蛋白的表达16。Yonghuan Zhao17等通过研究显示- 谷甾醇可以抑制胃癌细胞SGC-790

18、1的增殖， 同时诱导产生细胞毒性。 不同浓度的- 谷甾醇对其处理呈现出不同的凋亡学上的变化，如形态学变化、DNA损伤、增加 了蛋白酶原3和bax的表达、抑制bcl-2的表达等。显示-谷甾醇明显地抑制了细胞的 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 3 生长，会诱导胃癌细胞的凋亡。Atif B18等人证实-谷甾醇与抗雌激素药物泰莫西 芬合用可以有效控制乳腺癌细胞株MCF-7 and MDA-MB-231的生长。由此可以看 出-谷甾醇在治疗肿瘤中以发挥着重要的作用。 目前-谷甾醇被用于宫颈癌中的实 例不多，国内有研究证实-谷甾醇能明显的抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖，并显著促 进S期细胞的集聚，通过激光共聚

19、焦分析和蛋白免疫印迹法证实-谷甾醇能降低 SiHa细胞微管蛋白 和微管相关蛋白2的表达，并抑制细胞内微管的聚合19。 1.3 MicroRNAs 研究进展 1.3.1 MicroRNAs 的发现及形成 MicroRNAs (miRNAs) 是一些高度保守的、单链的非编码的RNA分子，大小 约19-24个核苷酸左右，它可在转录后水平上来调节基因的表达。第一个miRNA是 1993年在新秀丽小杆线虫中发现的20，随后Reirrhart21等人又在线虫中发现了 let-7。最后在2001年正式将此类小的基因命名为microRNA22。它们是由miR基因 编码的长的RNA转录本进行代谢加工而成的。它们

20、在植物、动物、病毒都能检测 到，并且与很多细胞生理过程有着密切的关系，如细胞增殖，分化，凋亡与新陈 代谢等23。在通常情况下，miRNAs会通过其自身基因沉默等功能来控制和调节细 胞的生理过程。有数据显示，哺乳动物全基因组中至少30%的量都受到miRNAs的 调控和作用24。 miRNAs 的生命起源是一个复杂多阶段的过程，它起始于细胞核中，结束于细 胞质中， 经过许多转录后修饰而成的。 形成的第一步是 RNA 聚合酶转录 miRNAs 的基因先形成前体 miRNAs(pri-miRNAs)， 它具有 5端的帽子和 3端的聚合 A 的尾 巴。Pri-miRNAs 是一个大的转录本，它包括大量的

21、 miRNAs 序列，在此阶段它会 形成多个发夹结构。核内的微小加工器，包括 RNA 聚合酶 Drosha 和一个双链 的 RNA 结合蛋白 DGCR8 将 pri-miRNAs 加工成大约 70 个核苷酸左右的 miRNAs 前体， 被称为 pre-miRNAs。 具有颈环结构的 pre-miRNAs 在输出蛋白 5 （exportin 5） 复合物的作用下被运输到细胞质中。在细胞质中存在着核酸内切酶 Dicer，它与它 的协助因子 TAR RNA 结合蛋白（TRBP）还有 PKR 激活蛋白（PACT）共同作用 对 pre-miRNAs 进行进一步的加工25。 Dicer 切断 pre-mi

22、RNAs 的颈环结构形成一个 21-24bp 的双链 miRNAs，在每个 3端都多出 2 个核苷酸26-27。其中一条链 5端比 较稳定被选为操纵链，而另一条链通常被降解。随后单链 miRNAs 被装载入 RNA 诱导的沉默复合体中（RISC）28-29。在与其整合之后，miRNAs 的碱基与其互补 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 4 的 m RNA 分子配对，当 miRNAs 与目标 m RNA 形成完全匹配或近乎完全匹配之 后，m RNA 被降解掉，在此过程中，如果 miRNAs 与其目标 m RNA 匹配程度不 好， 就会导致翻译受到抑制。 在哺乳动物中， miRNAs 分子能够结合很

23、多目标基因， 主要是因为这些基因 m RNA 的 3UTR 能与其配对。这也预示着每一个单链 miRNAs 都能够作用于或调控很多基因的表达30。 1.3.2 MicroRNAs 与癌症发生 目前，许多研究证实 miRNAs 与肿瘤的发生存在密切的联系，microRNAs 在 此过程中充当着十分重要的角色，有些 microRNAs 在多数肿瘤细胞中处于高表达 状态，如利用干扰的方式使其受到抑制，肿瘤细胞的生理过程会发生很大的变化， 如细胞增殖明显受到抑制，或侵袭能力下降，促进凋亡等，所以这类 microRNAs 在肿瘤细胞中起着致癌基因的作用。而有些 microRNAs 在多数肿瘤细胞中处于低

24、 表达状态，当使其上调时又会明显地抑制细胞的生长，这些基因可被视为抑癌基 因。 1.3.2.1 MicroRNAs 与宫颈癌 Qing Yao31等发现在宫颈癌 Hela 细胞中下调 hsa-miR-21 的表达，可以明显 地抑制 Hela 细胞的增殖，并且可以上调肿瘤抑制基因 PDCD4 的表达。他们证实 PDCD4 基因的 3UTR 序列是 hsa-miRNA-21 的功能性靶标，这个结果也证实了， hsa-miR-21 在宫颈癌细胞中起着致癌基因的作用，并且它也可以作为后续治疗工 作的靶标。 陈丽婷等32通过 microarray技术在 HeLa 细胞中检测经 ly294002 作用 2

25、4 h阻断 PI3K P Akt 通路后 microRNAs 的表达变化。结果显示：hsa-miR-30d 可 抑制 HeLa 细胞增殖 ,负性调节细胞生长 ,是一个潜在的抑癌基因。吴维光等33 人利用转染试剂将 Pre-miR-99b 的 miRNA Precursor 转染宫颈癌 Hela 细胞，得到 转染后 hsa-miR-99b 的表达增高 86.45 倍，细胞增殖能力下降，细胞凋亡率增加， 同时细胞 CDC-25A 蛋白表达降低，这个结果证实上调 hsa-miR-99b 表达可通过降 低靶基因 CDC-25A 表达来抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡 ,这也说明 hsa-miR-99b 可能

26、成为治疗宫颈癌的靶基因。Yang 等 34通过实验证明与正常组织相比 hsa-miR-214 在 Hela 细胞中被下调了，如果在 hala 细胞中使 hsa-miR-214 过表达， 通过 MTT 法和集落形成实验可以发现细胞的增殖是受到明显的抑制的。同时还证 实了过表达的 hsa-miR-214 下调靶标基因 MEK3 和 JNK1 在 m RNA 和蛋白水平上 的表达。最近，Ran Qiang等35人也通过研究找到 hsa-miR-214 在宫颈癌细胞中作 用的另一个靶标-Plexin-B1 它在 Hela 细胞中起着致癌作用，它促进了 Hela 细胞 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 5

27、 的增殖并提升了其入侵能力。Martinez1 等36，证实在 HPV-16 中 E6 蛋白存在的情 况下，hsa-miR-218 可以介导靶基因 LAMB3 的表达量增加。hsa-miR-886-5p 通过 下调 Bax基因的表达从而抑制宫颈癌细胞的凋亡37。由此可见 microRNAs 的变化 与宫颈癌的发生是息息相关的。 1.3.2.2 MicroRNAs 与其它癌症 Xiqiang Liu38等人通过实验证实，在舌鳞状细胞癌细胞（TSCC）中，通过上 调 hsa-miR-24 的量可以明显地减少 RNA 结合蛋白 DND1 的表达。如果敲除 hsa-miR-24 又会增加 DND1 的

28、表达，并通过生物信息学分析推测 DND1 是 hsa-miR-24 的直接靶标。同时证实这种 hsa-miR-24 介导的 DND1 的改变，进而抑 制了依赖性激酶抑制剂 1B （CDKN1B） 的表达， 从而促进的细胞的增殖， 抑制 TSCC 细胞的凋亡。Lin39证实在口腔鳞状细胞癌中(OSCC)中 hsa-miR-24 是高表达的， 并且 OSCC 病人血浆中的 hsa-miR-24 也普遍高于正常人中的。他们通过实验表明 hsa-miR-24 可以调控 OSCC 细胞的生长， 并预测 hsa-miR-24 的靶标可能是 p57。 Ian G. Cannell等40人提出 hsa-miR

29、-34c 可能的靶标是 c-Myc，在 DNA 受到损伤时，通 过抑制 hsa-miR-34c 的活性可以阻止 S 期的停滞，hsa-miR-34c 是 c-Myc 表达的重 要调控因子，它能够通过移除 c-Myc 来保护错误的 DNA 复制体，从而使基因组不 稳定。 在对头颈鳞状细胞癌的研究中，Xiqiang Liu 41使用微阵列的方法对不同的 miRNAs 进行检测得知，在高转移性的细胞中 hsa-miR-138 的量减少了，通过转染 技术， 导入 hsa-miR-138 会抑制细胞的侵袭， 导致细胞周期停滞从而促进细胞凋亡， 相反如果敲除 hsa-miR-138，又会使细胞侵袭能力增强

30、，抑制细胞凋亡。因此证实 miR-138 作为一种肿瘤抑制基因发挥着作用。Hsa-miR-155 在各种生理和病变过程 中都起着至关重要的作用， 也有证实表明 hsa-miR-155 与病毒的感染， 尤其是 DNA 病毒息息相关。hsa-miR-155 在许多恶性肿瘤中处于过表达的状态，因此可以将其 作为癌症诊断和预防的检测标准42，在对乳腺癌的研究中也有证实，hsa-miR-155 可能是通过作用于靶基因 MYC 从而增加其活性，MYC 明显地可以促进细胞凋亡 43。Jeong-Won Lee44等人利用基因芯片技术对 hsa-miR-200 家族中的成员进行检 测， 包括 hsa-miR-

31、141, hsa-miR-200a, hsa- miR-200b, hsa-miR-200c,and hsa-miR-429, 这些 miRNAs 在子宫内膜癌细胞(EECs)中与对照组相比都处于上调状态。通过使 用特意性的反义 miRNAs（包括 anti-miR-141, -200a, -200b, -200c, or -429,）处理子 宫内膜癌细胞时发现 anti-miR-200a, -200b, -200c, and -429 明显地抑制了 HEC-1A 细胞的生长，anti-miR-141, -200c, and -429 明显地抑制了 Ishikawa 细胞的生长。并 且转染了

32、anti-miR-429 之后加强了顺铂在 HEC-1A 细胞中的毒性作用。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 6 在对人类卵巢癌的研究中，hsa-miR-214, hsa-miR-199a*, hsa-miR-200a, hsa-miR-100, hsa-miR-125b, hsa-let-7 等都处于非常显著的下调状态，并且 hsa-miR-214 可以通过与靶基因 PTEN 的 3UTR 序列结合， 来诱导细胞存活和产生 顺铂耐药性，这使得 PTEN 的蛋白量下调，并激活了 Akt 途径，如果用 Akt 抑制 剂使其受到抑制，或导入没有 3UTR 序列的 PTEN 的 cDNA 可以大大地

33、降低 hsa-miR-214 所诱导的细胞存活几率。这些都证实 hsa-miR-214 所诱导的细胞存活 和顺铂耐药性主要是通过与 PTEN/Akt 路径相互作用引起的45。 许多研究表明 hsa-miR-34a 抑制了很多基因的表达，并且会诱导 G1 期停滞、 细胞凋亡和衰老等。Na Li46人在对肝癌的研究中发现 hsa-miR-34a 在肝癌组织 （HCC）中与正常邻近组织相比都明显的下调。并证实 hsa-miR-34a 与 c-Met-蛋白 之间存在着负相关性。在 HepG2 细胞中，hsa-miR-34a 的异常表达阻止了肿瘤细胞 的迁移和侵袭，hsa-miR-34a 是直接与 c-

34、Met 作用，从 m RNA 和蛋白水平上减少 了它的表达，因此也减少了 c-Met 所诱导了对细胞外信号调节激酶 1/2（ERK1/2） 的磷酸化作用。同时也有研究表明，let-7 在人类肺癌细胞中也处于低表达的状态， 这证实它也可能是作为一种抑癌基因受到了抑制，通过转染方式上调该基因可以 观察到细胞的增殖能力明显地受到了抑制，并且逐渐诱导细胞的凋亡47。另外在 肺癌细胞中， 如果敲除 miR-218b， 会使得细胞对酪氨酸激酶抑制剂非常的敏感48。 1.4 MicroRNAs 的检测方法 1.4.1 Northern blot 印迹 Northern blot方法，是比较快速简便的检测mi

35、croRNAs的方法之一，此方法通 常是与PAGE凝胶电泳连用，先通过PAGE将大小不等的RNA进行分离，这些RNA 通常是小于200bp的非编码序列。然后将目的microRNAs固定在杂交膜上，进行探 针标记，此过程中通常使用32P标记的ATP来修饰基因的5末端。将靶基因与所对 应的探针进行杂交，再通过放射自显影检测杂交信号。Northern Blot法在目前研究 中使用较少，它在操作方面耗时多，并且使用的放射性元素安全性还未能保证， 人们也在不断的发掘新的可替代的无危害的标记，另外此方法无法应对高通量的 靶基因检测，又由于它检测的灵敏度不高，在面对精密的分析和组织中含量极少 的miRNAs

36、的检测时，此方法只能通过增加样品的含量来解决，这样对于稀有样品 来说就会显得十分的困难，并且也对实验操作带来很多不便。49-51。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 7 1.4.2 实时荧光定量 PCR 检测技术 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术，通常是用来对microRNAs进行定量分 析的，它与Northern blot法相比具有很多优越性。它可以对miRNAs进行低丰度检 测，并且检测灵敏度很高，甚至可以精确到对单个miRNA分子的检测。但由于 miRNAs分子很小，所以在设计miRNAs的合成引物时，所能扩增出来的片段不仅 要带有miRNAs本身的20多个核苷酸序列，

37、还要在两侧多加上几十个核苷酸，便于 扩增。在进行反转录的时候，我们可以使用microRNAs专用设计的引物，也可用随 机引物来进行。在使用随机引物时，通常我们会在目的miRNAs的分子片段的末端 加上多聚A的尾巴，再利用随机引物Olog-dT的尾巴作为匹配引物进行反转录，用 此种方法后，就可以利用SYBRGreen PCR Master Mix进行荧光定量PCR。通常为 了提高扩增率，都会使用具有针对性的引物，此方法通常在设计引物时要使扩增 的片段比目的片段长度要大，这种大片段的序列中要包含目的miRNAs片段，但此 方法也增加了非特异性扩增的可能性，所以在对引物设计上要求就极其严格了。 运用

38、此类引物后在进行microRNAs的荧光定量PCR时，通常使用TaqMan Universal PCR Master Mix,因为此次探针可以提高检测的灵敏度52-54。 1.4.3 MicroRNAs 微阵列技术 微阵列芯片（Microarray）是一种大批量地检测 microRNAs 的技术，通常被用 于对组织中全 miRNAs 或大量 miRNAs 的扫描检测。此方法不仅可以对 miRNAs 进行定性分析，也可以进行定量分析。此方法是将目的 miRNAs 的反义片段固定 在芯片中，然后将我们要检测的 miRNAs 的 5末端加上放射性标记，再使两者杂 交，当样品中含有反义核苷酸所对应的目

39、的片段时，就会产生信号，通过放射自 显影就可以检测出标记，同时也可以通过信号强度进行定量分析。当前对于 miRNAs 的研究，多采用荧光信号，安全无害，并且操作简单，可以快速的对全 miRNAs 表达谱进行检测，并且具有很高的灵敏度，当前已被广泛应用于对肿瘤细 胞中 miRNAs 的检测中55-56。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 8 第 2 章 材料与方法 2.1 实验材料及仪器 2.1.1 材料与试剂 本实验所使用的细胞株： （1）人宫颈癌细胞株 Hela 细胞，来自中国医学科学 院肿瘤细胞中心； （2）耐药 Hela/DDP 细胞，来自上海艾研生物科技有限公司。 实 验所使用试剂主要如

40、表 2-1 所示。 表 2-1 实验试剂及来源 实验试剂 来源 DMEM 培养基 Thermo 胎牛血清 北京元亨金马生物技术开发有限公司 -谷甾醇(分析纯) 上海融禾医药科技有限公司 顺铂 齐鲁制药有限公司 DMSO Thermo PBS 磷酸缓冲盐溶液 Thermo 胰蛋白酶 GIBCO TRIZOL Invitrogen 反转录试剂盒 ABI TaqMan 引物与探针 ABI mirV ana miRNA Isolation Kit ABI TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit ABI TaqMan Universal PCR Master

41、Mix, No AmpErase UNG ABI TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 ABI Megaplex RT Primers, Human Pool Set v3.0 ABI High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits ABI 引物 Invitrogen SYBRGreen PCR Master Mix ABI 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 9 2.1.2 实验仪器 在实验过程中用到的仪器设备主要如表 2-2 所列： 表 2-2 实验仪器 仪器名称 来源 IMT-2 倒置显微镜

42、奥林巴斯有限公司 HHCP-7 CO2 细胞孵育箱 上海博迅实业有限公司 荧光定量 PCR 仪7300 型 ABI PCR 仪 Takara 公司 Biofuge Stratos 高速冷冻离心机 德国 Heraeus 公司 电泳仪 BioRad 公司 低速离心机 LD5-2A 北京医用离心机 70超低温冰箱 美国 ThermoQuest 公司产品 高速台式离心机（TGL，16G） 上海医用分析仪器厂 电子分析天平 日本 A具有的分子功能与核染色质结合，组氨酸去 乙酰化酶调节活性，与 MDM2 结合，与金属离子结合，通过调节 RNA 聚合酶 核心启动子临近区与 DNA 特异性结合的转录因子的活性

43、来正调节转录过程等 与RAC3相关的生物学过程有肌动蛋白微丝骨架组织， 细胞突起成分的组装， GTP 分解代谢过程，细胞内信号转导，神经肌肉过程控制平衡，神经元突起的形 成，调节小 GTPase 介导的信号转导，参与小 GTPase 介导的信号传导等；该基因 参与的细胞组成有胞液，细胞内膜系统，微丝肌动蛋白，生长锥，片足，神经元 突起，神经元胞体和质膜等；RAC3 主要有 GTP 结合蛋白，GTPase 活性和结合蛋 白等分子功能。 与 PDCD4 相关的生物学过程有参与凋亡过程，细胞老化过程，负调节细胞周 期，负调节 JUN 激酶活性，负调节依赖于 DNA 的转录等；该基因参与的细胞组 成有

44、细胞核和核仁，细胞质和胞液；PDCD4 主要有结合蛋白，特异的影响和非共 价地结合 RNA 等分子功能。 4.3.6 通过靶标反向查找 microRNAs 再次通过 Targetscan （http:/www.targetscan.org/） 数据库将以上得到的四种靶 基因（TP53、RAC3、PDCD4）为目标反向筛选，从数据库资源中找出可以检索出 来以其为靶标的相应 microRNAs，统计结果如表 4-5，具体见附录二。 表 4-5 与靶基因对应的 miRNAs 靶基因 MicroRNA TP53 hsa-miR-504，hsa-miR-218，hsa-miR-143 等 314 个 R

45、AC3 hsa-miR-504, hsa-miR-3662，hsa-miR-3163 等 82 个 PDCD4 hsa-miR-21，hsa-miR-34c，hsa-miR-302b 等 77 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 32 由表中结果可以看出，反向查询得到的 microRNAs 也是相应靶标所受之作用 的对应的 microRNAs。 4.3.7 MicroRNAs 与其预测靶标之间的能量学分析 根据功能富集分析结果显示,靶基因 TP53 ,RAC3,PDCD4 与细胞的存亡存在 着很明显的相关性,为了进一步验证它们是对应 microRNAs 的靶标基因，我们对其 进行了最小自由能的分析

46、及可能的二级结构推测。首先使用 NCBI 数据库 (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)检索出 TP53，RAC3, PDCD4，TIAM1 四种靶 基因的 3UTR 的核酸序列，其中所选取的序列片段是与 miRNAs 存在保守互补序 列的片段； 再利用miRbase(http:/www.mirbase.org/)数据库查找成熟的hsa-miR-504， hsa-miR-10b，hsa-miR-21，hsa-miR-143 的序列，其结果如表 4-6。 使用 RNAhybrid(http:/bibiserv.techfak. uni- bielefeld .de

47、/rnahybrid/)软件对靶 基因 3UTR 序列与相应 microRNAs 的序列推测其可能形成的二级结构， 从中可以 清晰地看出两者互补区域，并得到两者结合的最小自由能 MFE（Minimum Free Energy） 。再利用 RNAfold（http:/rna.tbi.univ ie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）软件对 每个 microRNA 中与靶基因互补的序列进行自身回折所形成的二级结构进行预测， 并得出 MFE，最后将两者进行比较。 Hsa-miR-21 与其靶基因 PDCD4 的结构匹配所形成的二级结构及最小自由能 分析结果及如表 4-7 表 4-7

48、 hsa- miR-21 与 PDCD4 能量分析的靶标验证 microRNA 与 PDCD4 的 3 UTR结合自由能 及二级结构预测示意图 与 PDCD4 互补序列自身回折结构示 意图及结合自由能 hsa-miR-21 mfe:-29.8 kcal/mol mfe:-24.3kcal/mol 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 33 表 4-6 miRNAs 与其靶基因可能配对的基因序列 基因 基因序列 hsa-miR-21 PDCD4 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAAC ACCAGUCGAUGGGCUG AGGGGGCAAGGAGGGACAG

49、AAAAGUAACCUCUUCUUAAGUGG AAUAUUCUAAUAAGCUA hsa-miR-50 4RAC3 TP53 AGACCCUGGUCUGCACUCUAUCUGUAUUCUUACUGAAGGGAG UGCAGGGCAGGGUUU UGGGGUGUGGCUCCAGCCUUCCCUGGCCCCCGCCGGAGGCCG GGAGGGAGCAGGGUCU CAGCCUCCCAGAGUGCUGGGAUUACAAUUGUGAGCCACCACG UCCAGCUGGAAGGGUCA hsa-miR-143 TP53 hsa-miR-10b TIAM1 GGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGUCAGUUGGGAGUCUGAGAUGA AGCACUGUAGCUC CCUUAGUACCUAAAAGGAAAUCUCACCCCAUCCCACACCCUG GAGGAUUUCAUCUC UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG CUUCAUGCCAACGAAACAGGGUA