乳酸杆菌产蛋白酶的凝乳特性及酶性质研究.pdf

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1、哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 目 录 摘 要.I Abstract.II 第 1 章 绪论 1 1.1 课题背景及研究的目的和意义 1 1.2 乳酸杆菌产蛋白酶研究现状 1 1.2.1 乳杆菌属 1 1.2.2 乳酸杆菌蛋白水解系统 4 1.2.3 蛋白酶在食品工业中的应用 8 1.3 本课题主要研究内容 9 1.3.1 乳酸杆菌高效产蛋白酶菌株筛选 9 1.3.2 乳酸杆菌来源蛋白酶的分离纯化 9 1.3.3 乳酸杆菌来源蛋白酶的酶性质研究 9 第 2 章 材料与方法 10 2.1 实验试剂 10 2.2 实验仪器及设备11 2.3 实验菌株.11 2.4 实验方法 12 2.4.1 菌种

2、活化与传代 12 2.4.2 活菌计数 12 2.4.3 脱脂乳平板法初筛 12 2.4.4 高效产蛋白酶菌株复筛 12 2.4.5 蛋白质浓度测定 12 2.4.6 蛋白酶活测定 13 2.4.7 SDS-PAGE 电泳. 14 2.4.8 凝乳实验 15 2.5 蛋白酶的分离纯化 16 2.5.1 产酶时间的确定 16 2.5.2 酶的粗分离 16 2.5.3 柱层析 17 2.6 酶的凝乳特性检验 18 2.7 酶的纯度检验和酶活得率分析 18 2.8 蛋白酶的酶性质研究 18 2.8.1 酶的最适温度及热稳定性 18 2.8.2 酶的最适 pH 及 pH 稳定性 19 2.8.3 金属

3、离子对酶活的影响 19 第 3 章 产有凝乳性质的蛋白酶菌株的研究 20 3.1 高效产蛋白酶菌株的初筛 20 3.1.1 活菌计数 20 - - III 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 3.1.2 脱脂乳平板法初筛 20 3.2 高效产蛋白酶菌株的复筛. 21 3.2.1 蛋白质含量测定. 21 3.2.2 蛋白酶活测定 22 3.3 凝乳实验 23 3.3.1 酸奶质构测定 23 3.3.2 表观粘度测定. 33 3.4 本章小结 35 第 4 章 蛋白酶的分离纯化 36 4.1 产酶时间的确定 36 4.2 酶的粗分离 37 4.3 柱层析 37 4.3.1 Sephadex G-75

4、葡聚糖凝胶柱层析 . 37 4.3.2 离子交换层析 42 4.4 酶的凝乳特性检验 44 4.5 酶的纯度检验和酶活得率分析 46 4.6 蛋白酶分子量测定 46 4.7 本章小结 47 第 5 章 乳酸杆菌产蛋白酶的酶性质研究 48 5.1 酶的最适温度及热稳定性. 48 5.1.1 酶的最适温度 48 5.1.2 酶的温度稳定范围 49 5.2 酶的最适 pH 及 pH 稳定性 . 49 5.2.1 酶的最适 pH 49 5.2.2 酶的 pH 稳定性. 50 5.3 金属离子对酶活的影响 51 5.4 本章小结 51 结论 52 参考文献 53 攻读学位期间发表的学术论文 58 哈尔滨

5、工业大学学位论文原创性声明及使用授权说明 59 致 谢 60 - - IV 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 1 第 1 章 绪论 1.1 课题背景及研究的目的和意义 伴随着人们生活水平的不断提高和生活节奏的逐渐加快，消费者对食品的营 养价值要求也日益提高。发酵乳制品因其独特的风味、口感和较高的营养价值， 已经成为人们生活中不可或缺的消费品。近年来，在对益生菌的不断研究和探索 中发现，部分乳酸菌能够治疗和预防某些疾病，对促进健康有着十分积极的作用。 在我国，发酵乳工业已经进入大规模的工业化生产，为了满足消费者日益增长的 需要，发酵乳制品在保证风味和营养价值的同时，还应进一步利用发酵过程中所 产生

6、的其他功能性物质提高产品的品质。 在酸奶生产中，德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌是传统的发酵剂。通 过研究发现，嗜热链球菌所产的胞外多糖具有一定的产粘特性，对酸奶质构品质 的提高有积极的作用。乳酸杆菌因其在发酵过程中胞壁蛋白酶和胞内肽酶的水解 作用，在形成干酪的质构和风味上都发挥很大作用，而乳酸杆菌产蛋白酶在酸奶 中的应用在国内并无相关研究。本论文拟通过高效产蛋白酶菌株的筛选，分离纯 化由乳酸杆菌所产的蛋白酶，探究其在发酵的过程中对酸奶质构的影响，进而为 酸奶发酵剂的选择提供参考，从而达到缩短凝固时间，减少稳定剂的添加的目的。 相信在未来的乳制品发展中，乳酸杆菌产蛋白酶在酸奶中的应用也会成为

7、另一个 研究热点。 1.2 乳酸杆菌产蛋白酶研究现状 1.2.1 乳杆菌属 乳酸菌是指一类能发酵糖类，主要产物为乳酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌的 总称。目前乳酸菌可分为包括乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、双歧杆菌属等至 少 23 个属。在实际的应用中乳酸菌主要参与食品营养、食品储藏、食品保健及动 物饲料产业，在日常生活中发挥着重要的作用。目前，已有大量不同学科的研究 证实，乳酸菌不仅广泛应用于工业生产，同时随着其对人体健康有益作用的不断 深入研究和揭示，乳酸菌也是人体和动物体内不可或缺的有益微生物。 乳杆菌属是乳酸菌的重要组成部分，是乳酸菌中最大属，目前已经确定该属 有超过 100 个种。而乳杆菌

8、目该属中大部分菌株为益生菌，其中部分菌株，如德 氏乳杆菌保加利亚亚种、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌等 已被广泛用于工业乳酸发酵、食品加工（香肠制作、泡菜腌制、酸奶生产、奶酒 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 发酵)、保健药物生产和饲料的加工等领域1。某些乳杆菌如嗜酸乳杆菌、德氏乳 杆菌保加利亚亚种，常用于饮料发酵工业。乳杆菌属广泛分布在自然界中，可以 利用沉淀反应将乳杆菌抗原分为A、B、C、D、E及F等 6 组2。 乳杆菌属革兰氏阳性菌，有细长杆形、短杆形等多种形态，大多成链或呈栅 栏状排列。无芽胞，无荚膜，多数无动力。DNA中G+C含量为 34.753.4%。厌氧 或兼性厌氧

9、3，最适温度介于 37-42 之间。在含有葡萄糖、酵母浸出液或血液培 养基上生长良好，因其能够利用糖类分解产生大量乳酸及其他酸类，对酸抵抗力 较强，在酸性环境pH 3.0-4.5 下仍能生存。乳酸杆菌可以根据糖发酵产物的不同分 为两类：即同种发酵和异种发酵。凡能发酵糖类只产生乳酸的菌株，称为同种发 酵型；若同时产生甲酸、醋酸、乙醇等其他产物，称为异种发酵型。也可以根据 生长温度不同分为两种，即如能在 43生长，称为高温发酵菌；若只能在 15 生长，称为低温发酵菌4。 在乳制品工业的生产中，德氏乳杆菌保加利亚亚种与嗜热链球菌混合发酵制 作酸奶，除了能够和嗜热链球菌协同作用快速产酸，德氏乳杆菌保加

10、利亚亚种所 分泌的蛋白酶能弥补了嗜热链球菌的不足5。作为传统发酵剂，德氏乳杆菌保加利 亚亚种的一些特殊代谢产物直接或间接作用于乳制品香气形成和后熟过程。乳杆 菌主要功能包括发酵分解乳糖，降低氧化还原电位，柠檬酸发酵和分解酪蛋白。 其中，分解酪蛋白是乳制品在发酵过程中形成质地和香气的主要原因6。 1.2.1.1 德氏乳杆菌保加利亚亚种 德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus，L. bulgaricus） ，隶属于乳杆菌属（Lactobacillus） ，为德氏乳杆菌种（Lactobacillus delbrueckii）的亚种

11、。该菌属于嗜酸乳杆菌群，其菌群是健康人胃肠道中的乳杆菌 三大菌群之一，是重要的益生菌，包括嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus） 、格 氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri） 、卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus） 、食淀粉 乳杆菌（Lactobacillus amylovorus） 、约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）等7。 在其中，德氏乳杆菌保加利亚亚种因其非典型的GC含量（G+C%为 49.7%）而独 一无二8。 在基因组测序方面，关于德氏乳杆菌保加利亚亚种也有很多实质性进展。当 前该菌的ATCC

12、 11842、 ATCC BAA-365 和 2038 菌株的全基因组序列已全部完成9， 另外认为因德氏乳杆菌保加利亚亚种的一些独特的基因组序列，支持了该菌种基 因组是处于快速进化的动态阶段的假设，如基因损失等10。该菌种全基因组序列 信息的公布，为快速准确鉴定该菌，提供了有力的帮助。当前以种属特异性PCR 和变性梯度凝胶电泳DGGE方法结合起来， 可以分析在不分离发酵乳中菌体的情况 下对包括德氏乳杆菌保加利亚亚种在内多种乳酸菌（如嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、 2 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 干酪乳杆菌和双歧杆菌等）的混合菌株进行选择性计数和检测11。研究者基于对 71 株不同种的乳酸杆菌的t

13、uf基因序列进行分析比较，发现在该基因的 95、169、 430 和 630 四个位置的碱基上，德氏乳杆菌保加利亚亚种含有独特的C-A-A-C碱基 组成，并由此设计两组特定引物（p95F/p169R和p430F/p630R）进行多重PCR反应 形成三个特定产物，大小分别为 105 bp、235 bp和 569 bp，从而能够可靠，快速， 一步鉴定出德氏乳杆菌保加利亚亚种12。 目前，作为最具有经济价值同型发酵的乳酸菌，德氏乳杆菌保加利亚亚种与 嗜热链球菌混合发酵广泛应用于酸奶的工业生产。在发酵过程中两种菌株能够稳 定共生并互相促进，即互利共生，如德氏乳杆菌保加利亚亚种产生的细胞壁蛋白 酶以及嗜

14、热链球菌产生的甲酸盐13-14。另外还有两株细菌间二氧化碳、丙酮酸、 叶酸等的组分交换都在近年来被广泛报道15。 J.Roland在基因水平上对两种细菌的 互作进行了研究，发现在其互利共生的过程中发生了水平基因转移的竞争性协同 进化，即胞外多糖的生物合成基因由嗜热链球菌转移到德氏乳杆菌保加利亚亚种， 而参与生产含硫氨基酸的基因簇cbs-cblB(cglB)-cysE由德氏乳杆菌保加利亚亚种转 移到嗜热链球菌16。在硬质乳酪生产中，德氏乳杆菌保加利亚亚种主要应用于帕 达诺干酪、爱芒特奶酪、波萝伏洛干酪等生产。 1.2.1.2 干酪乳杆菌 同作为益生菌的一种，干酪乳杆菌主要定殖在小肠部位，是人体肠

15、道中的重 要微生物，与人体的健康有着密切的联系，与嗜酸乳杆菌和双歧杆菌一起被誉为 “健康三益菌” 。 广泛应用于乳制品加工中， 由于能够适应干酪中高盐高酸的环境， 在切达干酪制作中应用较多。干酪乳杆菌能够通过菌体自身产生的肽酶进行氨基 酸代谢，以改善干酪风味同时提高质构，促进成熟17。近年来，干酪乳杆菌由于 其显著的益生功效，逐渐成为研究的焦点。关于其生长和发酵特性也有了一定的 研究。在国内，研究较多的是干酪乳杆菌LC-15，黄文利等确定了该菌株的发酵特 性，在脱脂乳中 37 下培养，10 h时可以使乳凝固，12 h时pH将达到 4.5。在发 酵过程中前期酸度变化不大，主要产生酮类物质和挥发性

16、脂肪酸，有一定程度的 后酸化现象； 与其他发酵菌混合培养可缩短约 4 h的发酵周期。 另外药敏实验表明， 对于一些常见抗生素，干酪乳杆菌LC-15 对链霉素、氟哌酸和庆大霉素不敏感；对 四环素、氯霉素和红霉素高度敏感18。 干酪乳杆菌的益生性能，主要表现在降低血清胆固醇、抗肿瘤、防治腹泻、 提高免疫力和降血压等几方面。近年来，随着人民生活水平的提高，高血压成为 一种常见疾病，而ACE抑制肽作为一种新的降压药物越来越受到人们的广泛关注。 干酪乳杆菌在以乳为基质的环境中生长时，通过自身代谢的胞外蛋白酶的作用将 乳蛋白中的特定组分分解（主要为-酪蛋白） ，可以产生多种ACE抑制肽19。黄 3 哈尔滨

17、工业大学工学硕士学位论文 文利等又对干酪乳杆菌LC-15 所产的ACE抑制肽的体外抑制活性进行了研究。 研究 发现该菌株对牛乳蛋白质的水解能力与体外测定ACE抑制活性呈现一定的正相关 关系，在脱脂乳中发酵至 42 h时，发酵乳所产生的ACE抑制率达到最高，为 66； 添加 4酪蛋白可以使ACE抑制活性提高至约 8020。 1.2.1.3 瑞士乳杆菌 瑞士乳杆菌属于嗜酸同型发酵乳杆菌，能够将葡萄糖、果糖、半乳糖等分解 为L-和D-乳酸的外消旋混合物。 该菌对营养要求十分苛刻， 最适生长温度为 37 ， 最适pH 5.5，研究者通过响应面法，优化已选择的碳源、氮源和缓冲盐类的质量浓 度组成，得到了

18、一株瑞士乳杆菌H9 的增殖培养基，相比于在普通MRS中，活菌数 提高 35 倍，为该株菌的进一步研究提供了基础21。瑞士乳杆菌对乳酸产生的产物 抑制物不敏感22。因此对瑞士乳杆菌产酸的研究比较广泛。研究表明，瑞士乳杆 菌与其他乳酸菌组合在纯牛乳和混合乳中产酸能力较强， 在低 pH条件下不受抑制 且生长良好，适合于发酵乳的生产制作23。华朝丽通过SAS正交设计，将瑞士乳 杆菌与丁二酮链球菌以 2:1 的比例混合发酵生产酸奶，所发酵的酸奶质地粘稠，具 有奶油香气，这主要是形成了以丁二酮为主的酮香酸奶。不同于传统利用德氏乳 杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌生产的以乙醛为香气的酸奶，拓展了酸奶品种新 领域

19、24。 瑞士乳杆菌具有较高的蛋白水解活性并生成多种蛋白酶，能够在干酪成熟的 过程中的水解作用提供风味前体物质，常与干酪乳杆菌组合生产切达干酪。研究 者通过加入 3 种不同的瑞士乳杆菌发酵剂，分析在成熟过程中所产生的游离氨基 酸、游离脂肪酸、挥发性物质，认为风味前体物质的组成差异主要是由于瑞士乳 杆菌自溶程度不同造成25。同作为益生菌的一种，瑞士乳杆菌同样有降低血清胆 固醇、抗肿瘤、防治腹泻、提高免疫力和降血压等功能特性。 1.2.2 乳酸杆菌蛋白水解系统 1.2.2.1 乳杆菌蛋白酶概况 在蛋白酶水解系统中，胞壁蛋白酶占有举足轻重的地位，能够将外源氮源如 酪蛋白（、）分解成寡肽和氨基酸，为胞内

20、肽酶提供水解底物和满足自身生 长需要。根据水解机制不同，副干酪乳杆菌产蛋白酶为PrtP，德氏乳杆菌保加利亚 亚种产蛋白酶为PrtB，瑞士乳杆菌为PrtH和PrtH2，鼠李糖乳杆菌产蛋白酶为 PrtR26。胞壁蛋白酶由约 2000 个氨基酸合成并含有多个特殊功能域。由N端开始 首先是信号序列S（约 30 aa） ，PP（约 150 aa） ，催化区域PR（约 500 aa） ，插入区 域I（约 150 aa） ，区域A（约 400 aa） ，区域B（约 500 aa）参与酶稳定性，螺旋区 域H（约 200 aa）参与定位，亲水区域W（约 100 aa）27。 不同乳酸杆菌所合成的蛋白酶，其分子量

21、大小多介于 70 kDa-180 kDa之间。 4 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 D. Atlan等从德氏乳杆菌保加利亚亚种NCDO 1489 得到由 1946 个氨基酸残基组成 分子量为 212 kDa的蛋白酶28。I. Tonic等从人工分离出的鼠李糖乳杆菌BGT10 中 获得了分子量大小为 154 kDa的蛋白酶29。H. Naes等从副干酪乳杆菌NCDO 151 中获得了分子量大小为 135 kDa的蛋白酶30。 但这并不代表所有的乳酸杆菌都有大 致的分子量，S.Garel等发现德氏乳杆菌保加利亚亚种能够合成大小为 65 kDa的蛋 白酶31。 1.2.2.2 蛋白酶的理化性质、酶学

22、性质 （1）德氏乳杆菌保加利亚亚种 德氏乳杆菌保加利亚亚种因其快速酸化的能力广泛应用于乳制品加工，但由 于自身是氨基酸营养缺陷型菌株，在乳制品发酵过程中，需要自身的胞壁蛋白酶 先将水解酪蛋白获得肽段和氨基酸。同时对酸奶质构和风味有一定影响，除此之 外，大量科学研究证明，某些德氏乳杆菌保加利亚亚种在发酵过程中能够释放有 益健康的生物活性肽32。虽然德氏乳杆菌保加利亚亚种分泌蛋白酶并不如芽孢杆 菌属、假单胞菌属数量可观，但在乳酸菌中是高产蛋白酶菌株，属于P-I型，优先 水解酪蛋白33。其蛋白酶的合成方式与其他乳酸菌如瑞士乳杆菌34、鼠李糖乳杆 菌35等相似。 德氏乳杆菌保加利亚亚种蛋白酶分子量介于

23、 80-145 kDa，除了目前发现的 CNRZ397 和ACA-DC235，绝大多数属于丝氨酸蛋白酶，能够在Ca2+缓冲液条件下 释放出来，由于菌体的自溶作用也可将胞壁蛋白酶看做胞外蛋白酶。德氏乳杆菌 保加利亚亚种所分泌的蛋白酶与菌体自身细胞具有相同的酪蛋白分解机制和模 式。D.Atlan等用不同的方法对德氏乳杆菌保加利亚亚种CNRZ397 进行了提取和纯 化，并对其胞外蛋白酶性质进行了研究。该菌株所分泌的蛋白酶分子量大小为 170 kDa，最适温度 42 ，最适pH为 5.536。H.Elvira等研究了培养基中的肽段含量对 德氏乳杆菌CRL581 合成的蛋白酶酶活的影响， 但只提供了较少

24、的信息。 G.M.Hebert 等通过添加不同氮源、盐类和糖类，研究这些成分对酶合成的影响，结果发现并 非所有的肽段都会减少蛋白酶的合成，一些不含支链氨基酸的二肽和三肽对酶合 成并无影响37。G.Savoy等对同一菌株CRL 581 在不同pH，温度和Ca2+浓度，对蛋 白酶的活力、稳定性及释放量进行研究。结果显示在pH 5.5 和 6.0 时处于对数增长 期的菌体所合成蛋白酶活力最高，大约有 40%的蛋白酶释放出来38。 （2）瑞士乳杆菌 瑞士乳杆菌能够同时含有两种蛋白酶分别为PrtH2 和PrtH，除此之外还有两个 假定的蛋白编码基因prtH3 和prtH4，但只有PrtH2 普遍存在于瑞

25、士乳杆菌中39-40。 M.Genay等对一些瑞士乳杆菌所产蛋白酶的一些生物学特性进行了总结41。 5 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 表 1-1 瑞士乳杆菌产蛋白酶生物学特性41 瑞士乳杆菌 已纯化酶 纯化方法 分子量(kDa)最适温度 最适 pH CNRZ303 是 离子交换层析 42 7.5 CP790 是 亲和层析 45 42 6.5 L89 是 疏水层析 180 50 7 (25,pH6.2) CP53 是 离子交换层析、 亲和层析 170 42 6.5 CRL581 否 42 7 CNRZ32 否 204 CRL1062 否 42 6.5 PR4 部分 离子交换层析 40 5.5

26、ZUC2 是 凝胶层析、 离子 交换层析 180 44 6 瑞士乳杆菌产蛋白酶均属于丝氨酸蛋白酶，金属蛋白酶类、胱氨酸蛋白酶类 及胃天冬氨酸蛋白酶累抑制剂对酶活力没有影响。通过上表可以看出，瑞士乳杆 菌最适温度范围 37-45 ，最适 pH 范围 6-7。 （3）干酪乳杆菌 干酪乳杆菌蛋白酶把能够把乳蛋白水解成一系列的短肽，这些肽类一部分释 放到培养液中，另一部分由寡肽转移系统(Opp)运输至细胞内后由胞内肽酶进一步 将短肽水解为氨基酸或更小的肽类， 这些肽类对血管紧张素转移酶(ACE)具有抑制 作用，从而达到降血压的效果42。因此对干酪乳杆菌产蛋白酶的研究比较广泛， 最早的报道是N. Ezz

27、at利用DEAE葡聚糖纤维素色谱法对干酪乳杆菌NCDO 151 的 胞壁粗提物进行纯化并进行相关特性的研究43。H. Ns关于同一菌株NCDO 151 所产蛋白酶性质有不同的研究结果， 认为该蛋白酶分子量为 150 kDa的丝氨酸蛋白 酶，酪蛋白作为底物时的最适pH为 5.6，最适温度为 35-37 ，在 50 下 20 min 失活44。 C.Ferna等利用硫酸铵沉淀法， 疏水层析和离子交换层析从干酪乳杆菌IFPL 731 中分离出大小为 150kDa的蛋白酶，最适pH 6.0，最适温度 40 45。G.Xue等 从分离的一株干酪乳杆菌HZ1 中分离出两个具有抑制ACE能力的生物活性片段

28、ACEI-2 和 ACEI-5，对ACE的抑制率分别能够达到 60.55% 和 71.71%46。 1.2.2.3 蛋白酶的酶活测定 （1）紫外吸收法 紫外吸收法主要是根据国家标准SB/T10317-1999 蛋白酶活力测定法进行蛋白 酶活测定47。其原理是测定水解后酪氨酸含量，利用标准曲线作为蛋白酶活力定 量的依据。具体方法为：取 1 mL 粗酶液于 37 预热 10 min，加入 37 预热的 2%酪蛋白 （以pH 7.0 PBS/Tris-HCl 配制） 1 mL， 反应 30 min， 再加入 2 mL 0.4 mol/ L 三氯乙酸（TCA）终止反应（对照先加TCA，后加底物） ，静

29、置 30 min，4000 g 6 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 离心 15 min，测上清液OD275值。与国家标准的福林酚方法相比较，紫外吸收法操 作简单，试剂易得，且准确度高，重现性好48。但该方法当在样品中含有其他吸 收紫外光物质时，会产生较大误差，且对蛋白酶浓度要求较高，比较适用于酶制 剂及高产量蛋白酶的测定。 （2）OPA 试剂法 OPA（邻苯二甲醛）试剂法是由F. Church在 1982 年提出的一种快速、便捷、 准确性高的光谱广度测量方法49，蛋白质被蛋白酶水解过程中释放出游离氨基酸， OP与游离氨基反应生成稳定的异吲哚衍生物，所测出的吸光值与标准曲线比较 间接反映蛋白酶活

30、力， 主要适用于在脱脂乳中菌体的水解能力测定。 吕加平等OPA 试剂的配制上进行了一定修改， 100 mL、 100 mol/L的硼酸钠, 10 mL 2%的SDS溶液, 160 mg OPA试剂溶于 4 mL甲醇中, 再加入 400 mol/L-巯基乙醇, 最后用重蒸馏水 定容至 200 mL, 放于阴凉处备用。 取样 330 L加入试管中, 再加入 3 L OPA 试剂, 混匀后,在室温下反应 2 min, 于 240 nm 处测定其吸光度值50。C. J. Oberg等利用 OPA试剂法能够测定 8 株瑞士乳杆菌和 14 株德氏乳杆菌保加利亚亚种所产蛋白酶 活力，虽然蛋白酶能够以 6 种

31、不同机制降解-酪蛋白，但该方法仍证明可行51。 （3）Azocasein 底物法 应， 再由TCA终止反应 前还没有能够水解-酪蛋白 乳酸亚种L. delbrueckii subsp. lactis CRL 581 为例，以s1-酪蛋 该方法是以显色底物azocasein与蛋白酶在最适温度下反 后，取上清与氢氧化钠混合显色后在 440nm下测吸光值。吸光值大小反映出酶活 力的高低52。在具体操作时，由于蛋白酶产量和活力有所差别，在底物与蛋白酶 的用量上各有不同。J. A. Guljarro在测定鲁氏耶尔森氏菌产蛋白时，是将 120 L酶 液加入到 480 L底物中保温 30min53；S. D

32、enkin是将 100L酶液加入到 100 L底 物中保温 30-60 min，测定鳗弧菌所产蛋白酶54；A.Hayashi是将 100L酶液加入到 400 L底物中保温 10 min55，测定乳酸菌E. faecalis TN-9。 1.2.2.4 德氏乳杆菌产蛋白酶水解酪蛋白的作用机制德氏乳杆菌产蛋白酶水解酪蛋白的作用机制 德氏乳杆菌能够水解-酪蛋白和-酪蛋白，目 的相关报道。无论在 MRS 培养基中还是在脱脂乳培养基，其蛋白酶的水解机制是 相同的。德氏乳杆菌所产蛋白酶水解-酪蛋白产生两个特有的产物 a1 和 a2 两个 肽段， 大小分别为 23 kDa 和 22 kDa， 而在水解-酪蛋

33、白时生成 2 个大分子量肽段 b2 和 b4，分子量分别为 19 kDa 和 18 kDa，另外还有两个随后自我水解的次级产 物 b1 和 b328。 以德氏乳杆菌 白和-酪蛋白作为底物分别得到 33 和 32 个肽段。其中水解s1-酪蛋白的肽段由 4 个到 44 个氨基酸残基组成， 其中包括 5 个磷酸化肽段 （Gln52-Glu96, Ser75-Gln82, Glu110-His121, Ser115-His121, Ser115 -Met123） 。另外， CRL 581 水解s1-酪蛋白 7 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 时有两个特有的水解位点Glu14-Val15 和 Glu18

34、-Asn19，不同于之前研究发现的任 何一种乳酸菌蛋白酶，根据界定蛋白酶类型的标准56，该株菌属于P-I和P-III混合 型57。水解-酪蛋白产生肽段由 3 个到 27 个氨基酸残基组成，其中包括 6 个磷 酸化肽段（Leu16-Gln39, Lys32-Glu42, Lys32-Asp43, Lys32-Gln46, Lys32-Phe52, Lys32-Gln56） ，不同于德氏乳杆菌保加利亚亚种ACA-DC 17858，CRL 581 能够水 解上游残基。在所生成的 32 个肽段中有 4 个与先前研究的乳酸杆菌蛋白酶水解 -酪蛋白产物相同，均在-酪蛋白的碳端。在一系列的水解产物中，I.

35、Tonic还发现 了一种具有抑制血管紧张素功能的三肽Ile-Pro-Pro29。 1.2.3 蛋白酶在食品工业中的应用 1.2.3.1 发酵乳制品工业发酵乳制品工业 发展，消费者对发酵乳制品的需求日益增加，干酪作为 一种 1.2.3.2 肉制品工业肉制品工业 ，肉类的嫩化加工工艺的研究一直是热点之一。嫩度不仅是 评价 菌种来源 分子量pH 值 温度 失活条件 最大酶活/（Ug-1） 随着乳品行业的高速 高端发酵乳制品也逐渐得到关注。作为一种重点研究的酶制剂，凝乳蛋白酶 由于可以专一地切割乳中 -酪蛋白所包含 Phe105-Met106 之间的肽键，通过破坏 酪蛋白胶束而使牛奶凝结，其蛋白酶水解

36、作用产生游离氨基酸形成特殊风味，因 此广泛应用于干酪工业生产。最初报道的凝乳蛋白酶是来自于于小牛的第四胃黏 膜，由于无法满足现代工业的需求，且成本较高，各国研究者先后开发了多种皱 胃酶替代品59。许多植物中也有能使乳凝固的蛋白酶，目前研究较多的包括木瓜 蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、合欢蛋白酶，生姜蛋白酶，朝鲜蓟蛋白酶 等60。微生物因其具有生长周期短，产量高，生产成本低，提取方便等优点，是 目前凝乳蛋白酶来源最有前途和潜力的发展方向。 目前在 1/3 的干酪生产均利用微 生物来源的凝乳蛋白酶。目前已发现有 40 余种微生物可生产一定活力的凝乳蛋白 酶，表 1-2 为部分微生物来源凝乳蛋白

37、酶特性及凝乳最适条件。 表 1-2 凝乳酶特性及凝乳最适条件 (kDa) Mucor pusillus 1-62 6530mi ） 6 49 5.0 50 （n48300 Mucor miehei63-65 38 5.6 40 65 （30min）120） A 34 3 60 70 0（SU spergillus oryzae666.3 55 n） 40000 Endothia parasitica67 68 4-396.7 （5mi Penicillium oxalicum 69 6.0 60 Rhizopus oryzae Ba 65 34 5.5 40 cillus subtilis n

38、atto 37 12000 在肉制品工业中 能够直观的评价肉类品质，也是肉类重要的感观特征。蛋白酶肉类嫩化剂是 8 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 一类主要成分为蛋白酶，专门用于嫩化肉类的生物制剂，目前商业化的肉类嫩化 剂主要为植物蛋白水解酶。这类蛋白酶能够在适当的温度条件下，切割蛋白质中 的某些肽键使其断裂，降解胶原纤维和结缔组织中的蛋白质等一系列生化反应， 从而使肉的品质变得柔软、适口、多汁，由此提高了肉的成品率、保质期，增加 了经济效益71。 风干肠俗称“干肠” ，因其口味独特，营养价值高，是发酵肉制品的一个重要 类别 团改良剂，酶制剂在烘焙食品中的应用已经有 50 多年的历 史73 的

39、有 效方 乳酸杆菌高效产蛋白酶菌株筛选 凝乳 、超滤系统和柱层析等方法分离提 纯该 pH 稳定性、温度 稳定 。在生产过程中，蛋白质的分解是重要的生化反应，当蛋白酶参与水解反应 中造成蛋白质肽键的断裂，不单单在口感上具有一定的嫩度，作用过程中所释放 的游离氨基酸和寡肽对改善香肠的滋味具有重要作用72。 1.2.3.3 烘焙食品工业烘焙食品工业 作为一种天然的面 。面粉中蛋白酶活力通常很低，制作面包时可以通过控制蛋白酶的添加量， 达到使面团中多肽和氨基酸含量增加的目的， 这样一来不单可以减少约 2/3 的调粉 时间，增加延展性，更因为氨基酸是形成香气必要产物，多肽会影响面团的风味， 从而使面团的

40、组织结构和风味得到提高，面包质地紧密，具有柔软的触感。 在饼干生产中，在不影响营养成分的的前提下，添加蛋白酶是软化面筋 法。如针对薄脆型的韧性饼干生产中，添加中性蛋白酶能够对韧性饼干自然 断裂的现象有着显著的抑制效果74，提高企业的经济效益。 1.3 本课题主要研究内容 1.3.1 针对 44 株乳酸杆菌进行高效产蛋白酶菌株的筛选，通过脱脂乳平板法初筛， 实验复筛，得到高效产蛋白酶菌株。 1.3.2 乳酸杆菌来源蛋白酶的分离纯化 利用筛选出的菌株提取蛋白酶，采用离心 蛋白酶酶，在纯化过程中比较分离纯化方法并优化柱层析的最佳分离条件。 1.3.3 乳酸杆菌来源蛋白酶的酶性质研究 测定纯化后的蛋白

41、酶样品的最适反应 pH、最适反应温度、 性等酶学性质。 9 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 第 2 章 材料与方法 2.1 实验试剂 实验中所用的主要试剂如表 2-1 所示。 表 2-1 实验中的主要试剂 名称 规格 产地 脱脂乳粉 生化试剂 雀巢公司 分析纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 酵母浸粉 分析纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 蛋白胨 分析纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 牛肉粉 分析纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 葡萄糖 分析纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 乙酸钠 分析纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 柠檬酸钠 分析纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 磷酸氢二钾 分

42、析纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 磷酸二氢钾 分析纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 吐温 80 分析纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 硫酸锰 分析纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 硫酸镁 琼脂 优级纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 考马斯亮蓝 G-250 生化试剂 Amresco 公司 无水乙醇 分析纯 天津市百世化工有限公公司 磷酸 分析纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 牛血清白蛋白 生化试剂 Roche 公司 磷酸氢二钠 生化试剂 北京益利精细化学品有限公司 磷酸二氢钠 分析纯 北京益利精细化学品有限公司 Azocasein 生化试剂 Sigma 三氯乙酸 分析纯 天津市百世

43、化工有限公公司 氢氧化钠 分析纯 天津市百世化工有限公公司 浓盐酸 分析纯 天津市百世化工有限公公司 Tris-碱 分析纯 天津市百世化工有限公公司 十二烷基硫酸钠 生化试剂 美国 Bio-Rad 公司 甲叉双丙烯酰胺 生化试剂 美国 Bio-Rad 公司 丙烯酰胺 生化试剂 美国 Bio-Rad 公司 生化试剂 美国 Bio-Rad 公司 过硫酸氨 TEMED 生化试剂 美国 Bio-Rad 公司 考马斯亮蓝 R-250 生化试剂 Amresco 公司 甘氨酸 生化试剂 美国 Bio-Rad 公司 溴酚蓝 生化试剂 美国 Bio-Rad 公司 冰乙酸 分析纯 天津市百世化工有限公公司 分析纯

44、 天津市百世化工有限公公司 甲醇 葡聚糖凝胶 SephadexG-75 生化试剂 青岛海洋化工有限公司 PEG20000 分析纯 天津市百世化工有限公公司 丙酮 分析纯 天津市百世化工有限公公司 10 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 2.2 实验仪器及设备 实验中所用的主要仪器与设备如表 2-2 所示。 表 2-2 实验所用的主要仪器 实验仪器 型号 生产厂家 紫外可见分光光度计 UV-5100 上海元析仪器有限公司 pH 计 PHS-2C 上海雷磁仪器厂 垂直板电泳槽 164-5050 美国 Bio-Rad 公司 电泳仪 164-5050 美国 Bio-Rad 公司 粘度计 DV-E Vis

45、cometer 美国 Brookfield 公司 超低温冰箱 ULT1386-3-V Thermo 公司 冻干机 RLPHR1-4 德国 Marin Christ 公司 离心机 TGL-16LG 上海安亭科学仪器厂 高速冷冻离心机 3-30K Sigma 公司 电冰箱 RCD-243G 广东科龙电器有限公司 百分之一电子天平 SL502N 北京赛多利斯公司 万分之一天平 BS124S 北京赛多利斯公司 超滤系统 Millipore Labscale TFF 美国 Millipore 公司 质构仪 TA-XT 英国 PA 公司 蛋白质纯化仪 AKTK-100 美国 GE 公司 恒温磁力搅拌器 H

46、J-3 常州国华仪器有限公司 层析试验柜 YC-1 北京博医康实验仪器有限公司 电热恒温干燥箱 202-3A 上海新诺仪器设备有限公司 电热恒温水浴锅 DK-S26 上海精密实验设备有限公司 2.3 实验菌株 所选菌种为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus，L. bulgaricus）6 株，分别为 SP1.1、MYC、SH3 4.3、01A、CH9-3 4.0、 M01A、MN 3 4.5；从米酒中分离的乳酸杆菌（Lactobacillus）14 株，分别为 1-2、 1-3、1-4、1-6、2-15、2-16、2-17

47、、2-18、3-2、3-5、3-7、3-10、3-11、3-12；从干 酪中分离出乳酸杆菌（Lactobacillus）24 株，分别为 A1、A2、A3、B1、B2、B3、 C1、C2、C3、C4、C5、D1、D2、D3、D4、D5、E1， E2、E3、E4、F1、F2、 F3、F4，共 44 株，均保藏于哈尔滨工业大学食品学院。 11 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 2.4 实验方法 2.4.1 菌种活化与传代 灭菌铂耳环将储存的菌粉少量接入到 115 灭菌后的脱脂乳管中 37 培养， 革兰氏染色镜检确定无杂菌后，同样方法传代三次，使其活力恢复。灭菌铂耳环 将活化好的菌株挑入 MRS 培养

48、基，厌氧条件下 37 培养。之后以 2%接种量在 MRS 中活化 3 次75。 2.4.2 活菌计数 菌液在 600 nm 下 OD 值达到 1.4 左右时将菌液进行逐级稀释，采用三个连续 稀释梯度 10-5,10-6,10-7，取 100 L 菌液采用浇注平板法，确定活菌数目，每个稀释 度三次重复。 2.4.3 脱脂乳平板法初筛 2.4.3.1 脱脂乳平板 首先在平板中倒入 1.5%琼脂培养基， 待琼脂凝固后倒入混有 0.75%琼脂和 5% 脱脂乳的培养基。操作时应注意先配制 10%的脱脂乳培养基和 1.5%的琼脂，待培 养基温度降到 40 左右时混合配制成含有 0.75%琼脂的 5%脱脂乳

49、的培养基，温 度过高时混合会发生沉淀。 2.4.3.2 产蛋白酶菌株初筛 将活化后菌液振荡混匀取 1 L，接种于脱脂乳固体培养基表面上，37 下培 养。观察菌落形成情况，使用游标卡尺测量透明圈与菌落直径，并计算其比值76。 2.4.4 高效产蛋白酶菌株复筛 将在脱脂乳平板中透明圈直径与菌落直径比值较高的菌株以 2%接种量接入 5 mL MRS 培养基中， 37 下培养 16 h。 发酵液在 4 条件下， 8000 g， 离心 15 min， 得上清液即粗酶液。测定粗酶液的蛋白浓度及蛋白酶酶活进行菌株复筛，以单位 蛋白的酶活性表示(U/mg)，即比酶活。 2.4.5 蛋白质浓度测定 各分离纯化步骤中蛋白浓度的测定采用 Bradford 法测定